定向进化氨基酰-tRNA合成酶实现体内超突变高效拓展遗传密码

研究人员针对非经典氨基酸（ncAAs）在蛋白质中位点特异性掺入效率低下的难题，通过OrthoRep介导的体内超突变技术，对氨基酰-tRNA合成酶（aaRS）进行定向进化。该研究在酿酒酵母中成功开发出8种高效正交aaRS/tRNA对，可特异性识别13种ncAAs，其中部分系统效率接近天然翻译水平，并意外发现具有自我表达调控功能的aaRS变体。这项工作为遗传密码扩展（GCE）领域提供了高效、可扩展的酶工程平台，显著推动了合成生物学和蛋白质工程的应用潜力。

　　

在蛋白质科学与工程领域，遗传密码扩展（Genetic Code Expansion, GCE）技术通过将非经典氨基酸（non-canonical amino acids, ncAAs）定点插入蛋白质，为研究蛋白质结构、开发新型生物疗法和设计功能化酶提供了强大工具。然而，传统方法依赖耗时费力的体外进化手段，且获得的氨基酰-tRNA合成酶（aminoacyl-tRNA synthetases, aaRSs）往往存在ncAAs掺入效率低、宿主适应性差等瓶颈问题。尤其在真核生物如酿酒酵母中，GCE技术发展相对滞后，严重限制了其在抗体药物偶联物开发、翻译后修饰研究等重要领域的应用。

针对这些挑战，来自国外研究机构的Yuichi Furuhata、Gordon Rix等研究人员开发了一种基于正交复制系统（Orthogonal Replication system, OrthoRep）的体内超突变平台。该系统通过在酵母中持续诱发aaRS基因的高频突变（每碱基10^-5替换率），结合流式细胞术分选策略，实现了aaRS的自主快速进化。相关突破性成果发表在《Nature Communications》上。

研究主要采用三项关键技术：1）OrthoRep系统介导的体内连续进化，通过错误倾向型正交DNA聚合酶（epDNAP）实现靶基因超突变；2）双荧光报告基因（RFP-GFP）比率检测系统，定量评估琥珀密码子（TAG）的翻译效率；3）正负双向选择策略，同步提升ncAAs依赖的翻译活性和底物特异性。

在"Evolution of aaRSs with OrthoRep"部分，研究人员设计了包含8个独立进化实验的方案。以AcFRS、LeuOmeRS等4种aaRS为亲本，针对AzMF、IF等13种ncAAs开展定向进化。通过引入epDNAP和分选循环，获得的aaRS变体使相对读通效率（Relative Readthrough Efficiency, RRE）最高提升至1.014（MaPylRS/PhK-A），意味着ncAAs掺入效率已达到天然氨基酸翻译水平。

"Characteristics of evolved aaRSs"详细揭示了进化变体的分子特征。例如AcFRS/AzMF-2变体仅需W260L单突变即可显著提升活性，该位点远离底物结合口袋，传统定点突变策略极易遗漏。质谱分析证实进化aaRSs能精确将ncAAs插入sfGFP报告蛋白的指定位点。值得注意的是，MaPylRS变体在0.009 μM PhK浓度下即可检测到信号，灵敏度比亲本提高8500倍。

"Surprise evolution of autoregulation"报告了意外发现：AcFRS/AzMF-2-F变体在Q345位自发产生琥珀密码子，形成ncAAs依赖的自调控正反馈回路。该机制使背景活性降低5倍，而ncAAs存在时活性保持，显著提升了系统严谨性。这种自我调节模式此前仅见于人工设计系统，这是首次通过定向进化自然获得。

讨论部分强调，该平台在三个维度取得突破：技术层面，OrthoRep实现了aaRS的"全基因"进化，克服了传统方法局限于活性位点的缺陷；应用层面，进化aaRSs在E.coli等异源宿主中保持活性，证实了跨物种适用性；理论层面，自调控aaRS的发现为合成基因电路设计提供了新元件。这些进展将加速GCE在生物医药（如位点特异性抗体偶联药物）、基础研究（如蛋白质动态示踪）等领域的应用。

该研究不仅建立了高效的aaRS进化范式，更通过体内超突变揭示了蛋白质功能进化的新规律。正如作者指出，未来可直接将多样化aaRS文库装载至OrthoRep，进一步拓展ncAAs的化学多样性，为合成生物学开辟更广阔的设计空间。