强大的表达系统揭示 NaV1.9 通道独特门控机制及钙调蛋白调控

为解决 NaV1.9 通道因异源表达困难导致的门控特性研究不足问题，研究人员开发高效表达协议，结合嵌合构建与 ITC 技术，发现其 C 尾（含 IQ 基序、EF-hand）调控电流密度，且钙调蛋白（CaM）结合弱，为通道机制研究提供新平台。

　　

论文解读

在生命科学领域，电压门控钠离子通道（Na_V）家族对神经元电信号传导至关重要。其中，Na_V1.9 作为一种独特亚型，因激活和失活动力学缓慢，在静息膜电位附近产生持续钠电流，被认为与神经元兴奋性调节密切相关。然而，长期以来，Na_V1.9 在异源系统中难以稳定表达，导致其门控机制和调控因素研究进展缓慢。多数研究只能依赖背根神经节（DRG）神经元的内源性表达，但该方法受其他通道亚型干扰且难以进行基因操作，极大限制了对其功能的深入解析。

为突破这一困境，研究人员开发了一种高效的 Na_V1.9 异源表达系统。通过将小鼠 Na_V1.9（mNa_V1.9）cDNA 克隆至 pcDNA3.4 载体，并在 ND7/23 细胞中与 β₁、β₂亚基共转染，结合低温孵育和细胞内液添加氟离子等优化步骤，成功在 80% 以上的转染细胞中记录到稳定电流。该系统不仅能重现 DRG 神经元中 Na_V1.9 的典型门控特性，如超极化激活电压、去极化失活电压依赖性和缓慢动力学，还为后续机制研究提供了可靠平台。

研究人员利用构建的人 Na_V1.9（hNa_V1.9）与 Na_V1.5 嵌合通道，发现 C 末端区域（尤其是 IQ 基序和 EF-hand 结构域）是调控电流密度的关键。通过等温滴定量热法（ITC）证实，Na_V1.9 的 C 尾与钙调蛋白（CaM）的结合亲和力显著低于其他 Na_V亚型，生理条件下几乎无法结合。进一步研究表明，pre-IQ 区域虽不影响通道表达，却决定了 Na_V1.9 独特的去极化失活电压依赖性，揭示了其门控机制的分子基础。

此外，研究还验证了该表达系统在病理突变研究中的应用。针对与痛觉缺失和慢性瘙痒相关的 p.L799P（小鼠）和 p.L811P（人类）突变，发现其导致激活电压显著超极化、失活显著减慢，持续电流大幅增加，与 DRG 神经元中的表型一致，证明了该系统在疾病相关通道功能研究中的可靠性。

关键技术方法

1. 异源表达与电生理记录：利用 ND7/23 细胞瞬转系统结合全细胞膜片钳技术，记录 Na_V1.9 电流并分析门控参数。
2. 嵌合通道构建：通过结构域替换构建 hNa_V1.9 与 Na_V1.5 的嵌合通道，定位功能调控区域。
3. 等温滴定量热法（ITC）：测定 Na_V1.9 C 尾与 CaM 的结合热力学参数，验证相互作用强度。

研究结果

1. 异源 mNa_V1.9 表达与功能表征

优化的表达协议使 mNa_V1.9 在 ND7/23 细胞中稳定表达，电流密度随时间增加，激活电压超极化，失活缓慢，且 GTP-γ-S 可增强电流并加速失活。与 DRG 神经元相比，异源表达的 mNa_V1.9 在失活电压依赖性和动力学上存在差异，提示细胞环境对通道功能的影响。

2. hNa_V1.9 嵌合通道的表达与功能

hNa_V1.9 单独表达时电流微弱，而替换其 C 尾为 Na_V1.5 的嵌合通道（hNa_V1.9-1.5Ctail）电流密度显著提升。反向嵌合实验显示，hNa_V1.9 C 尾降低 Na_V1.5 电流密度，表明 C 尾影响通道转运或翻译效率。

3. CaM 与 Na_V1.9 C 尾的结合研究

ITC 显示，hNa_V1.9 的 IQ 基序与 CaM 结合亲和力极低（K_d≈37μM），含 pre-IQ 和 EF-hand 的扩展 C 尾结合亲和力进一步降低。pre-IQ 区域的替换导致 Na_V1.5 失活电压依赖性向 Na_V1.9 偏移，表明该区域独立调控失活特性。

4. 病理突变的功能分析

mNa_V1.9^p.L799P和 hNa_V1.9^p.L811P突变导致激活电压超极化、失活减慢和持续电流增加，与疾病表型一致，证实了表达系统在病理机制研究中的价值。

结论与意义

本研究建立了可靠的 Na_V1.9 异源表达系统，揭示其 C 末端通过弱 CaM 结合调控电流密度，pre-IQ 区域决定失活电压依赖性。这些发现不仅解析了 Na_V1.9 独特的门控机制，还为电压门控离子通道的结构 - 功能研究提供了通用平台。此外，系统在病理突变中的成功应用，为相关神经疾病（如痛觉异常）的发病机制和药物开发奠定了基础。该研究成果发表于《SCIENCE ADVANCES》，为 Na_V1.9 领域的研究提供了关键工具和新见解。