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早期内体在蛋白质组调控中起关键作用，但其动态蛋白复合物及相互作用机制尚不明确。研究人员通过交联质谱（XL-MS）、蓝色原生凝胶共分级质谱（BN-MS）结合 AlphaFold 分析，构建人类早期内体结构互作组 EndoMAP.v1，验证新复合物，为理解内体功能及相关疾病提供框架。
细胞内的 “物流枢纽”：早期内体的结构互作之谜与 EndoMAP.v1 的破局之路
在细胞的复杂运作中，早期内体（early endosome）如同精密的 “物流枢纽”，负责分拣细胞膜蛋白，决定其是循环利用还是降解于溶酶体。这一过程依赖多种瞬时关联的调控复合物和膜整合组件，但目前仅少数蛋白组分的结构与互作机制被解析，大量分子组装体的信息仍笼罩在迷雾之中。例如，早期内体动态成熟过程中， Rab5+早期内体向 Rab7+晚期内体的转化涉及 ESCRT 介导的蛋白运输，但相关复合物的高阶结构如何调控这一过程尚未明确。此外，帕金森病等神经退行性疾病与内体 - 溶酶体系统功能异常密切相关，而内体蛋白互作网络的缺失限制了对疾病机制的深入理解。
为填补这一空白，哈佛大学医学院（Harvard Medical School）的研究团队开展了一项系统性研究，相关成果发表于《Nature》。研究人员以早期内体抗原 1（EEA1）为标记，通过免疫沉淀（Endo-IP）富集人类早期内体，结合交联质谱（XL-MS）、蓝色原生凝胶共分级质谱（BN-MS）等技术，构建了首个早期内体结构互作组图谱 ——EndoMAP.v1，揭示了 229 个蛋白对及高阶组装体的结构模型，并通过诱导神经元（iNeurons）验证了新复合物的功能，为解析内体蛋白互作机制提供了关键资源。
关键技术方法
研究采用双重复合物组学策略：
- XL-MS：利用可裂解交联剂 DSSO 对完整内体进行交联，捕获近邻蛋白对，共鉴定 13,877 个交联位点，其中 4,793 个涉及内体蛋白，97% 符合拓扑连通性，验证了内体完整性。
- BN-MS：通过蓝色原生凝胶电泳分离内体蛋白复合物，结合质谱分析，鉴定 3,914 个蛋白，捕获 3,306 个候选互作蛋白对，涵盖 BORC、HOPS 等已知复合物。
- AlphaFold 整合分析：结合 AlphaFold Multimer（AF-M）和 AlphaLink2，对 4,165 个蛋白对进行结构预测，生成 229 个实验支持的结构模型，其中 162 个为全新预测。
核心研究结果
1. 早期内体互作网络的全景刻画
研究构建的互作网络包含 1,933 个节点和 4,282 条边，呈现幂律分布，平均最短路径距离为 6.2。网络核心模块富集 V-ATP 酶、SNARE 复合物等已知组件，并发现帕金森病相关基因显著富集，提示内体功能异常与神经退行性疾病的潜在关联。例如，DisGeNET 分析显示，帕金森病相关基因在早期内体蛋白组中富集程度最高，且相关蛋白在网络中紧密连接，路径距离仅约 5.0，暗示其互作紊乱可能驱动疾病进展。
2. 新复合物的发现与验证
- TMEM230 作为脂质翻转酶亚基：通过 AF-M 预测 TMEM230 与 ATP11B、TMEM30A 形成异源三聚体，BN-MS 显示三者共迁移，且存在 TMEM230-ATP11B 交联位点（Cα-Cα 距离 17.6?）。在诱导神经元中，TMEM230 缺失或突变（如 R78L、X121W）导致其与 ATP11B、ATP8A1/2 互作丧失，伴随突触囊泡循环相关蛋白（如 RAB3A、SORL1）在早期内体中异常富集，揭示 TMEM230 通过稳定脂质翻转酶复合物调控内体 - 质膜蛋白运输。
- TMEM9/9B 作为氯离子 - 质子反转运体亚基：CLCN3/4/5 与 TMEM9/9B 存在交联支持的互作，AF-M 预测四聚体结构，其中 TMEM9 的两个跨膜段与 CLCN3 形成特异性结合界面。敲除实验显示，TMEM9/9B 缺失导致 CLCN3/5 蛋白丰度显著降低，提示其作为核心亚基维持复合物稳定性，参与内体酸性环境调控。
3. 高阶复合物的结构建模与功能推演
通过三节点团簇（three-way clique）分析，研究解析了 Retromer-Rab7A 复合物、BORC 复合物等高阶组装体的结构。例如，Retromer 亚基 VPS35 与 GTP 结合态 Rab7A 的互作模型显示，Rab7A 通过 C 端脂质锚定膜表面，其 GTP 酶结构域与 VPS35 的 C - 螺旋 solenoid 结构域结合，为 Rab7A 招募 Retromer 至内体提供结构解释。此外，V-ATP 酶与 mTORC1-ragulator 复合物的 “超级组装体” 假设模型，通过交联数据支持两者的空间 proximity，暗示内体酸化与营养信号通路的直接互作。
研究结论与意义
EndoMAP.v1 首次系统性整合实验数据与计算预测，构建了人类早期内体的结构互作图谱，不仅验证了 TMEM230、TMEM9/9B 等新亚基，还为解析内体动态过程（如囊泡融合、蛋白分选）提供了结构基础。该资源揭示内体互作网络与神经退行性疾病的紧密关联，例如帕金森病相关蛋白在网络中的枢纽作用，为靶向内体复合物开发疾病干预策略开辟了新方向。
未来研究可基于 EndoMAP.v1 进一步拓展至其他内体亚群，解析完整膜蛋白复合物的化学计量，并结合冷冻电镜验证高阶结构模型。这一工作为细胞器互作组学研究提供了通用方法论，有望推动对细胞内复杂功能网络的深度理解。
