头对头双六聚体组装与解离揭示猴痘病毒E5介导的DNA解旋起始机制

为解决猴痘病毒(MPXV) E5解旋酶-引发酶融合蛋白在DNA复制起始阶段的分子机制问题，研究人员通过冷冻电镜技术解析了E5在不同酶促状态下的结构。研究发现E5形成头对头双六聚体环绕dsDNA，并通过核苷酸掺入引发的构象重排实现从dsDNA捕获到ssDNA转运的转换。该研究首次阐明了E5介导的DNA解旋模型，为理解病毒基因组复制起始提供了新视角，相关成果发表于《Nature Communications》。

　　

DNA复制是生命体延续遗传信息的核心过程，对于双链DNA(dsDNA)病毒而言，其基因组复制机制既保守又独具特色。猴痘病毒(MPXV)作为全球关注的病原体，其编码的E5蛋白是一种将解旋酶(helicase)和引发酶(primase)功能域融合的多功能酶，在病毒基因组复制中扮演关键角色。然而，这类融合酶如何起始DNA解旋、各功能域如何协同工作等核心问题长期未解，成为病毒复制研究的重要空白。

为揭示这一机制，国内多个研究机构合作开展了系统性研究。研究人员首先通过冷冻电镜(cryo-EM)解析了E5在apo状态、与DNA/ATP复合状态下的高分辨率结构，分辨率达到2.88-3.33 ?。利用DNA解旋和引物延伸实验验证了E5的多功能性，包括DNA解旋、RNA引物合成和DNA依赖的聚合酶活性。通过构建DDD/A(引发酶失活)、KRR/A(ATP酶失活)等关键突变体，结合冷冻电镜二维分类和三维重构技术，捕捉到E5从双六聚体组装到解离的动态过程。研究还采用局部精修策略提升柔性区域的分辨率，并通过核苷酸密度分析阐明了ATP水解循环的分子机制。

研究结果部分，在"Biochemical characterization and the apo structure of MPXV E5"中，发现E5具有典型的六聚体结构，其N端引发酶域在apo状态下呈现高度柔性。通过DNA聚合实验证实E5兼具PrimPol(引发酶-聚合酶)活性，能利用dNTPs和NTPs延伸引物。

"Rearrangement of the primase configuration derived by nucleotide incorporation"部分显示，ATP结合诱导引发酶域构象重排，形成稳定的ZBD(锌结合域)-AEP(古菌-真核引发酶)组装体。冷冻电镜密度图中观察到ATP分子结合在引发酶催化核心，这种构象会部分阻碍解旋酶通道。

"Conformational changes of E5 helicase upon DNA and ATP binding"揭示了E5解旋酶域在底物结合后发生显著构象变化。四个稳定原体(protomer)的AAA+结构域向ssDNA结合通道内移，形成紧凑排列，而两个柔性原体保持apo状态构象。这种"向内-向上-侧向"运动不同于典型的SF3解旋酶。

"Nucleotide cycling and dynamic landscape of E5 helicase conformation"部分阐明了ATP水解循环与构象动态的关联。研究发现E5采用非经典的护送(escort)转运模型：三个ATP稳定位点、两个ATP水解位点和一个核苷酸周转位点构成连续水解循环，驱动原体间协同运动。关键的核苷酸感应基序(Nucleotide sensor motif)在ATP结合时形成双平行β螺旋，维持催化核心稳定性。

"Head-to-head E5 double hexameric assembly for dsDNA capture"是研究的突破性发现。在无ATP条件下，E5通过引发酶域形成头对头双六聚体，环绕dsDNA。这种组装具有内在柔性，最大倾斜角达65°，类似于真核MCM解旋酶的起始构象。引人注目的是，ATP加入会完全破坏双六聚体组装，说明核苷酸结合是E5从dsDNA捕获转向ssDNA转运的关键外部触发因素。

"Functional relevance of the helicase and primase domains of E5"通过截断突变体实验证明，解旋酶域可作为DNA支架增强引发酶功能。ssDNA结合能力(RF/A突变)而非ATP酶活性(KRR/A突变)是支持引发酶功能的关键，揭示了功能域间的进化保守性关联。

这项研究系统阐明了E5介导的病毒DNA解旋起始模型：从双六聚体dsDNA捕获、ATP触发的构象重排与双六聚体解离，到非经典护送模型的ssDNA转运。该发现不仅揭示了poxvirus独特的复制起始机制，更重要的是为理解广泛存在于病毒和质粒中的解旋酶-引发酶融合蛋白的进化意义提供了结构基础。研究提出的"核苷酸循环驱动构象转换"机制，为开发靶向病毒复制起始环节的新型抗病毒药物提供了理论依据。论文中建立的实验体系和方法也为研究其他复杂多功能酶系统提供了范式。这项工作由山西高等创新研究院冷冻电镜中心等国内机构合作完成，展现了我国在病毒结构生物学领域的研究实力。