工程化谷氨酸tRNA高效抑制致病性无义突变：拓展tRNA治疗新策略

本研究针对由无义突变（PTCs）引发的遗传疾病治疗难题，开发了高效抑制谷氨酸（Glu）密码子PTC的工程化tRNAGluV13。通过理性设计反密码子茎环（ASL）结构，该tRNA对UAG/UAA终止密码子的通读效率提升20倍以上，并在BRCA1、CFTR和TP53基因模型中成功恢复功能性蛋白表达（达野生型40-60%）。质谱证实其精准插入谷氨酸的特性，为11%由Glu密码子PTC引发的疾病（如遗传性乳腺癌、囊性纤维化）提供了首个靶向治疗工具。

　　

研究背景与科学问题
遗传疾病中约11%由无义突变（premature termination codon, PTC）引发，这类突变将氨基酸密码子提前变为终止密码子（UAG/UAA/UGA），导致蛋白质合成中断。尽管靶向PTC的小分子药物（如ataluren）和tRNA疗法已有探索，但谷氨酸（Glu）密码子突变（占PTC热点11%）长期缺乏有效干预手段——现有谷氨酰tRNA（tRNA^Glu）经反密码子改造后通读效率极低，而小分子药物无法精准插入Glu。

研究设计与创新
印第安纳大学医学院与康涅狄格大学医学院的Caitlin Specht等通过理性设计tRNA^Glu的反密码子茎环（ASL），构建出高效抑制型tRNA^GluV13。其核心创新在于：1）引入C32-A38碱基对增强核糖体A位点结合；2）优化G30-C40茎环稳定性。研究通过双荧光素酶报告系统、SEAP（分泌型碱性磷酸酶）和GFP（绿色荧光蛋白）模型验证通读效率，并利用质谱分析氨基酸插入准确性。

关键技术方法

1. 双荧光素酶报告系统：通过Renilla-Firefly双荧光素酶比值量化UAG/UAA通读效率；
2. Northern blot：监测工程化tRNA的细胞表达稳定性；
3. 体外氨酰化实验：验证tRNA^GluV13与谷氨酰tRNA合成酶（GluRS）的相互作用；
4. 功能拯救模型：在BRCA1（E1535X/E1836X）、CFTR（E60X/E1418X）和TP53（E204X/E298X）突变细胞中评估蛋白功能恢复；
5. SPQ荧光检测：定量CFTR氯离子通道活性。

研究结果

1. 工程化tRNA^Glu提升UAG抑制效率
通过对比人类tRNA^Glu-1-1和tRNA^Glu-2-1两种异构体，发现ASL中C32-A38突变使UAG通读效率提升20倍（图1E）。移植该结构至其他tRNA（如tRNA^Lys、tRNA^Trp）未显类似效果，表明优化策略具有氨基酸特异性。

2. 精准插入谷氨酸的验证
质谱分析显示，tRNA^GluV13在GFP150X模型中95%插入Glu，仅4%为赖氨酸（Lys）（图2D）。这一特性显著优于小分子药物（如G418）的混杂氨基酸插入。

3. 多基因疾病模型的功能恢复

• BRCA1：tRNA^GluV13使E1535X突变体转录激活活性恢复至野生型63%，远超G418（无显著效果）（图4B）；
• CFTR：E60X突变体的成熟蛋白（C-band）占比达80%，SPQ检测显示氯离子通道功能接近VX-445/661联合治疗组（图5C）；
• TP53：在结直肠癌（C2BBe1）和肺癌（SK-MES-1）细胞中，内源性p53蛋白表达及转录活性恢复>20倍（图6B）。

4. 表达系统优化
三拷贝U6启动子构建使UAG通读效率提升3倍（图3F），为体内递送提供了剂量参考。

结论与意义
该研究首次实现了谷氨酸密码子PTC的高效精准纠正，填补了tRNA疗法在Glu突变热点领域的技术空白。tRNA^GluV13的模块化设计为其他低效sup-tRNA（如tRNA^Leu）的优化提供了新思路。其临床转化潜力体现在：1）覆盖CFTR第五大常见致病突变E60X；2）规避小分子药物的错义风险；3）在BRCA1和TP53模型中展示广谱治疗价值。未来需解决体内递送效率（如AAV载体优化）和truncated蛋白潜在毒性等挑战。

（注：所有数据与结论均源自原文，未添加非文献支持信息）