基于表达匹配对照的邻近标记互作组高置信度分类研究

本研究针对TurboID邻近标记技术中因表达差异导致的假阳性和假阴性问题，通过系统评估不同对照策略，提出表达匹配的TurboID-eGFP对照方案。研究人员利用RNF10和HUWE1两种泛素连接酶模型，证实匹配表达水平可显著降低背景干扰，提高互作蛋白鉴定准确性，为邻近标记蛋白质组学研究提供了标准化实验框架。

　　

在细胞生物学研究领域，解析蛋白质相互作用网络如同绘制生命活动的分子地图。邻近标记技术（Proximity labeling, PL）作为近年来兴起的强大工具，通过酶催化标记（如TurboID）能在活细胞中捕获目标蛋白（bait protein）周围的"分子邻居"。然而这项技术面临一个关键挑战——TurboID固有的"滥交"特性会导致广泛的非特异性标记，如何区分真实互作与背景噪音成为领域内亟待解决的难题。

传统解决方案主要依赖阴性对照实验设计，但不同实验室采用的对照策略差异巨大，从完全缺失TurboID表达的细胞到表达游离TurboID的细胞不一而足。更棘手的是，TurboID表达水平与标记效率直接相关，而现有研究鲜少关注对照与诱饵蛋白（bait）之间表达量匹配的重要性。这种标准化缺失导致不同研究间的数据可比性差，假阳性（false-positive）和假阴性（false-negative）鉴定频发，严重制约了邻近标记技术在蛋白质互作研究中的可靠性。

为系统解决这些问题，研究人员开展了一项创新性研究。通过构建可诱导表达的TurboID-eGFP对照系统和TurboID-RNF10/TurboID-HUWE1诱饵系统，结合流式分选和多重表达调控策略，首次建立了梯度表达的TurboID对照库。借助高精度质谱（timsTOF Pro2）和新型数据非依赖采集（DIA）技术，定量分析了不同表达水平下背景蛋白的标记特征。研究发现TurboID表达量与标记蛋白总数（R²=0.97）及信号强度呈强正相关，而表达不匹配会导致显著的数据偏倚——当对照表达低于样品时产生假阳性，反之则导致假阴性。

关键技术方法包括：1）建立Flp-In诱导系统和PiggyBac转座系统调控TurboID表达；2）流式细胞术分选不同GFP荧光强度的细胞亚群；3）基于timsTOF Pro2的dia-PASEF质谱采集技术；4）DIA-NN软件进行数据非依赖分析；5）多种定量算法（Top1/xTop/MaxLFQ）比较；6）limma包进行差异表达分析。

研究结果部分，"Evaluation and Characterization of Different TurboID Controls"表明：TurboID-eGFP对照能捕获更全面的背景蛋白（3552个特有蛋白），且覆盖各丰度区间，显著优于无TurboID或未加生物素的传统对照。"TurboID Expression Significantly Alters Background Labeling"揭示：TurboID表达量变化会非均匀影响不同丰度蛋白的标记效率，低丰度蛋白相对强度变化可达高丰度蛋白的3倍（60.2倍vs 20.3倍），而常规归一化方法难以完全校正这种偏差。

"Optimizing Control TurboID Expression"部分证实：当使用6小时诱导的TurboID-eGFP（表达量匹配24小时诱导的TurboID-RNF10）时，能准确鉴定出RNF10已知互作蛋白UBE2D2/3和核糖体蛋白RPS3/RPS2，而错配表达会导致内源性生物素化蛋白ACACA等被误判为互作蛋白。"HUWE1 Substrate Identification"进一步验证该策略可识别HUWE1的真实底物如MCL1和HAPSTR1，且高频互作蛋白（如VCPIP1）在多对照分析中重现性最佳。

讨论部分强调，这项研究建立了包含TurboID表达检测与匹配步骤的标准工作流程。通过量化证明表达匹配对照可使归一化数据和非归一化数据的一致性从39%提升至82%，显著提高结果可靠性。该方案不仅适用于TurboID，也可推广至BioID、UltraID等其他邻近标记系统。研究提出的"多梯度对照"策略为大规模互作组研究提供了实用解决方案——使用低、中、高表达水平的有限对照库即可覆盖不同表达量的诱饵蛋白。

这项发表于《Molecular 》的研究，首次系统阐明了TurboID表达量对互作组数据质量的定量影响规律，建立了表达匹配的标准化实验框架。其创新性在于将工程学中的"匹配设计"理念引入蛋白质组学研究，为解决邻近标记技术的核心瓶颈提供了方法论突破。该成果不仅提高了蛋白质互作研究的准确性，对疾病相关蛋白网络解析和药物靶点发现也具有重要应用价值，标志着蛋白质组学研究向更高精度迈出了关键一步。