肿瘤基因型-表型关系的体内组合功能基因组学与空间转录组学解码研究

研究人员开发了PERTURB-CAST方法，通过改造RNA模板连接探针，将扰动图谱与10X Visium空间转录组技术整合，实现了在同一组织切片上同时进行扰动定位和全转录组表型分析。结合CHOCOLAT-G2P框架，该研究在自发嵌合型肝脏肿瘤模型中解析了高阶组合扰动对肿瘤生态系统的表型影响，揭示了VEGFA和mtCTNNB1在胆管癌发展中的表观遗传调控作用，为理解肿瘤基因型-表型关系提供了新工具和新见解。

　　

癌症作为一种复杂疾病，通常由多种遗传改变共同导致。然而，由于患者间遗传多样性、普遍存在的上位性效应以及多细胞组织环境的复杂性，人类样本研究难以准确解析这些遗传改变如何共同重编程细胞及其与组织环境的相互作用。虽然模型系统中的遗传筛选在解码基因型-表型关系方面具有价值，但现有方法在从体外环境过渡到描绘其在组织中的表型后果方面仍存在局限。特别是在研究遗传改变如何通过上位性共同重塑肿瘤细胞及其周围细胞生态系统方面，仍存在重大知识缺口。

德国癌症研究中心（Deutsches Krebsforschungszentrum, DKFZ）的Marco Breinig等研究人员在《Nature Biomedical Engineering》发表研究，开发了PERTURB-CAST方法，通过改造RNA模板连接（RTL）探针，将扰动图谱与商业化的10X Visium空间转录组技术整合，实现了在同一组织切片上同时进行扰动定位和全转录组表型分析。结合CHOCOLAT-G2P（Charting Higher-Order Combinations Leveraging Analysis of Tissue to investigate Genotype-to-Phenotype relationships）框架，该研究建立了一个可扩展的实验平台，用于在组织水平上功能性地探索复杂的基因型-表型关联。

研究主要采用了三项关键技术：1）RUBIX（Random Unique Barcode Integration Combinatorics）系统，通过睡美人（Sleeping Beauty）转座子介导的质粒随机整合，在单个组织中产生遗传异质性的肿瘤克隆嵌合体；2）PERTURB-CAST空间转录组技术，重新部署商业化的10X Visium RTL探针进行分子条形码识别；3）CHOCOLAT-G2P分析框架，通过贝叶斯模型将空间条形码信号转换为克隆图谱，并建立基因型-表型关联。

RUBIX生成高阶组合扰动

研究团队修改了自发嵌合型小鼠肝脏癌症模型，通过水动力尾静脉注射（HDTV）混合的分子条形码质粒，在肝细胞中稳定整合可追踪的高阶遗传改变组合。在概念验证中，研究人员模拟了与肝癌相关的8种改变组合，包括致癌驱动因子（Myc、突变型Ctnnb1（mtCtnnb1）、Vegfa和NICD）的过表达和肿瘤抑制因子（Trp53、Pten和Kmt2c）的shRNA沉默，以及常用的Renilla荧光素酶（shRen）靶向对照构建体。通过RUBIX系统，研究人员在单次实验中测试了2⁸=256种可能的癌症驱动基因型。

PERTURB-CAST通过探针捕获进行条形码定位

PERTURB-CAST利用了10X Visium空间转录组技术中基于RTL探针的靶向转录本捕获策略。研究人员在扰动质粒中加入了50个核苷酸（nt）的条形码，这些条形码能够被RTL探针捕获。通过重新部署10X Visium中不在小鼠肝脏中表达的化学感应受体转录本的RTL探针序列作为分子条形码，实现了对引入扰动的检测。为确保稳健性，每个扰动质粒中都嵌入了三重条形码阵列。

空间扰动定位

研究人员使用变分贝叶斯模型将扰动分配到每个结节，该模型考虑了多个变异来源。结节水平的预测在连续组织切片之间以及10X Visium和10X CytAssist实验之间显示出良好的相关性（Pearson相关系数r=0.63-0.78）。通过靶基因表达水平的调查，研究验证了预期的过表达或沉默趋势，包括Notch1表达增加和Pten表达减少，以及Kmt2c和Trp53的表达变化。

共存癌症克隆的比较分析

在324个已识别的结节中，贝叶斯模型计算了由8种扰动组合定义的所有256种可能基因型的概率。研究发现，肿瘤克隆通常表现出组合性改变，其中五重组合最为普遍（约30%）。已知致癌基因如Myc（82%结节）和mtCtnnb1（80%）的改变发生频率最高，表明存在强烈的克隆选择，而VEGFA（53%）和shRen（46%）则较少见，可能反映了较低的致瘤潜力。

癌症驱动共依赖性和潜在环境依赖性

通过共现比值比（OR）分析，研究揭示了Myc、mtCtnnb1和NICD以及shTrp53和shPten之间的共依赖模式。特别值得注意的是，Myc和NICD组合显示出最显著的效果（OR=1.64；P=0.067），而VEGFA与NICD（OR=0.68；P=0.036）以及VEGFA与mtCtnnb1（OR=0.67；P=0.064）之间则表现出相互排斥的趋势，表明VEGFA的致癌效应具有环境依赖性。

工程化肿瘤异质性的表型景观

通过组织范围的转录特征，研究定义了普遍细胞状态的转录本集，并在其空间背景下可视化表型相关的转录特征。研究区分了肝脏肿瘤的显著亚型，包括具有胆管细胞样转录特征的胆管癌（CCA）结节、与代谢性肝脏分区相关的门静脉样和中央样结节，以及富集Hamp2和Upp2表达的结节亚群。空间分辨率还揭示了肿瘤-基质和肿瘤-免疫细胞连接，包括在肿瘤-基质边界显著的成纤维细胞相关转录特征，以及区域分离的造血/免疫细胞簇相关表达模式。

复杂基因型-表型关系

通过结合表型和基因型数据的空间图谱，研究发现CCA与VEGFA呈强正相关，与mtCtnnb1呈强负相关。与WNT信号在肝脏分区中的核心作用一致，门静脉样肿瘤与mtCtnnb1呈负相关，而中央样结节则呈正相关。这些基因型-表型观察结果与人类HCC的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据一致，表明该研究方法能够反映人类HCC生物学的特征。

胆管癌发展的表观遗传调控

研究通过"留一法"实验设计，直接评估了VEGFA和mtCTNNB1对肿瘤发展和表型的个体贡献。结果显示，在测试的组合改变背景下，VEGFA表达对CCA发展至关重要，而mtCTNNB1对这一特定肝脏肿瘤亚类具有显性表观遗传掩蔽效应。

该研究建立的CHOCOLAT-G2P框架结合PERTURB-CAST方法，为在单个小鼠中进行高阶组合癌症筛选提供了多重方法。其设计基于使用现成空间转录组协议的PERTURB-CAST，便于从同一样本中全面读取肿瘤基因型和空间表型。这一方法不仅有助于解决关于多种遗传改变如何共同塑造疾病表型这一长期存在的问题，还为未来扩展到其他疾病模型、扰动和（空间）组学技术奠定了基础，有望广泛应用于解码组织乃至整个生物体整体背景下的复杂基因型-表型关系。