贝伐珠单抗联合安罗替尼通过抑制HIF-1α在非小细胞肺癌中发挥协同抗血管生成与抗肿瘤作用

本研究发现贝伐珠单抗（Bevacizumab）与安罗替尼（Anlotinib）联合治疗（B+A）可显著抑制非小细胞肺癌（NSCLC）的血管生成与肿瘤进展，其机制主要通过下调PI3K/AKT/HIF-1α信号通路实现。研究结合微流控芯片模型、体外实验与体内异种移植模型，证实联合治疗可协同抑制VEGFR2/PDGFRβ/FGFR1磷酸化、逆转上皮-间质转化（EMT）、促进CD4+/CD8+ T细胞浸润并调节细胞因子谱，为NSCLC治疗提供新策略。

　　

1 引言

非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌病例的85%，其治疗面临耐药性与肿瘤异质性挑战。血管生成是肿瘤进展的关键过程，抗血管内皮生长因子（VEGF）抗体贝伐珠单抗与多靶点酪氨酸激酶抑制剂安罗替尼分别通过不同机制抑制血管生成，但二者联合作用的机制尚不明确。本研究通过微流控芯片模拟血管生成微环境，结合分子分析与动物实验，探讨联合治疗的协同效应及其依赖的HIF-1α信号通路。

2 材料与方法

研究采用三层结构微流控芯片（PDMS通道+PMMA储层+玻璃基底）共培养GFP标记的人脐静脉内皮细胞（GFP-HUVECs）与正常人肺成纤维细胞（NHLFs），构建功能性血管网络。药物处理包括贝伐珠单抗（200 μg/mL）、安罗替尼（10 μM）及联合用药（B+A），并通过血管密度、直径、节点数及灌注实验评估血管功能。体外实验使用NSCLC细胞系A549与H1299，检测细胞活力（CCK-8法）、克隆形成、凋亡（Annexin V/PI流式术）、侵袭（Transwell）及迁移（划痕实验）。分子机制通过Western blot、qRT–PCR与ELISA分析信号通路蛋白（PI3K/AKT/HIF-1α）、EMT标志物（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、α-SMA）及细胞因子（TGF-β、TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6等）。体内实验采用BALB/c裸鼠A549异种移植模型，评估肿瘤体积、重量、免疫组化（Ki-67、CD4、CD8）及TUNEL凋亡检测。HIF-1α功能通过抑制剂PX478（5 μM）与激活剂DMOG（200 μM）验证。

3 结果

3.1 微流控芯片平台的血管生成验证

芯片成功构建连续互通的血管网络，联合治疗（B+A）4天后使血管密度降至对照的10%，直径从60 μm降至10 μm，节点数从500降至不足50。荧光葡聚糖灌注与微珠实验显示联合组血管通透性完全丧失，表明血管功能被彻底破坏。

3.2 抗血管生成与抗肿瘤效应

联合治疗显著抑制A549与H1299细胞活力（78%）、克隆形成（90%）及侵袭（75%），并诱导凋亡（增加3.85倍）。Western blot显示B+A下调间质标志物N-cadherin（5.34倍）、Vimentin（6.46倍）、α-SMA（4.35倍），上调上皮标志物E-cadherin（3.75倍）。血管生成受体磷酸化（p-VEGFR2、p-PDGFRβ、p-FGFR1）被强烈抑制，且HUVEC迁移与侵袭实验证实该效应依赖HIF-1α信号。

3.3 体内抗肿瘤效果

小鼠模型中，联合治疗使肿瘤体积减少7.23倍、重量减少7.08倍，Ki-67表达降低68%，生存期延长20天。Western blot显示细胞周期蛋白（Cyclin B1、p-CDK1）下调，凋亡蛋白（Bax、Cleaved Caspase-3）上调。免疫组化显示CD4⁺与CD8⁺ T细胞浸润显著增加，且TUNEL染色证实内皮细胞（CD31⁺）、上皮细胞（CK7⁺）与基质细胞（α-SMA⁺）凋亡均增强。

3.4 HIF-1α通路的调控作用

联合治疗以剂量与时间依赖方式抑制PI3K/AKT/HIF-1α通路，HIF-1α蛋白表达下降82%。下游代谢基因（Ang2、GLUT1、LDHA、PDK1）转录水平同步降低。添加HIF-1α激活剂DMOG可逆转B+A对血管生成受体磷酸化与EMT的抑制效应，而抑制剂PX478无进一步增效，证实HIF-1α是贝伐珠单抗作用的关键靶点。

3.5 免疫微环境调节

ELISA显示联合治疗降低免疫抑制因子（TGF-β、IL-6、IL-8、IL-10），提升促炎因子（TNF-α、IFN-γ、IL-2），且该效应可被DMOG部分逆转。表明B+A通过抑制HIF-1α重塑肿瘤免疫微环境，促进抗肿瘤免疫应答。

4 讨论

本研究通过创新微流控模型证实B+A协同抑制NSCLC血管生成与肿瘤生长，机制上依赖HIF-1α通路调控及其对EMT、代谢重编程与免疫微环境的双重调节。联合治疗克服单药耐药性，并通过促进T细胞浸润与细胞因子平衡增强免疫活性。局限性包括芯片复杂度不足与体内模型单一，未来需整合免疫细胞并拓展临床验证。

5 结论

贝伐珠单联合安罗替尼通过靶向HIF-1α介导的PI3K/AKT信号通路，协同抑制血管生成、逆转EMT并激活抗肿瘤免疫，为NSCLC提供具潜力的联合治疗策略。微流控芯片平台为抗血管药物筛选提供高效工具。