电针通过调控肥大细胞外泌体MiR-149-5p修复IBS-D大鼠肠道黏膜屏障的机制研究

本研究发现电针（EA）通过下调CRF/CRF-R1信号通路抑制肥大细胞活化，减少其外泌体（MC-EXOs）中miR-149-5p的释放，从而上调紧密连接蛋白（ZO-1、Occludin、Claudin-1）表达，改善肠道屏障功能，为腹泻型肠易激综合征（IBS-D）提供了新的治疗靶点和机制依据。

　　

背景

肠易激综合征（IBS）是一种常见的功能性胃肠道疾病，其中腹泻型（IBS-D）是最常见的亚型之一，给全球数百万人带来显著的医疗和经济负担。肠道屏障功能障碍是IBS-D的关键病因，而肥大细胞在这一过程中扮演着关键角色。先前的研究表明，电针（EA）能够通过下调下丘脑和结肠组织中CRF-R1的表达，缓解焦虑和抑郁样行为，上调紧密连接蛋白的表达，并抑制黏膜肥大细胞的过度活化，从而减轻IBS-D症状。然而，肥大细胞及其下游靶点驱动疾病发展的确切机制尚需进一步探讨。

外泌体是细胞分泌的微囊泡，含有多种微小RNA（miRNAs）和其他生物活性物质，反映细胞状态并促进细胞间通讯。在IBS患者中，肥大细胞来源的外泌体（MC-EXOs）与症状严重程度呈正相关，表明MC-EXOs可能参与IBS的发病机制。体外实验表明，MC-EXOs通过将miR-223转移至肠上皮细胞（IECs），下调Claudin-8蛋白表达，增加肠道通透性。这些发现提示MC-EXOs及其携带的miRNAs可能是IBS的潜在治疗靶点。

方法

研究采用慢性不可预见温和应激（CUMS）联合番泻叶溶液灌胃的方法诱导雌性Sprague Dawley大鼠IBS-D模型，并通过内脏疼痛阈值、腹泻指数（DI）和开放臂停留时间百分比（OT%）等行为学评估确认模型成功。模型大鼠接受电针治疗，同时结合肥大细胞激动剂C48/80、CRF-R1激动剂Ucn1或外泌体拮抗剂GW4869进行干预。

通过qPCR检测结肠组织中CRF和CRF-R1的mRNA表达水平；透射电镜（TEM）和免疫组化（IHC）观察肥大细胞活化和脱颗粒情况；ELISA、TEM、Western blot（WB）和IHC评估肠道屏障完整性和紧密连接蛋白表达。提取、测序腹膜肥大细胞来源的外泌体（MC-EXOs）中的miRNAs，并进行Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）富集分析。此外，将miR-149-5p和miR-22-5p mimics转染至Caco-2细胞，评估这些miRNAs对肠道通透性和紧密连接蛋白表达的影响。为进一步验证miR-149-5p的作用，给IBS-D大鼠注射过表达miR-149-5p的腺相关病毒（AAV），并评估肥大细胞活化和肠道屏障功能。

结果

电针治疗通过下调CRF和CRF-R1表达、抑制肥大细胞活化以及上调紧密连接蛋白表达，有效缓解了IBS-D症状。CRF和肥大细胞激动剂可取消电针的保护作用，而外泌体抑制剂则增强其效果。MiRNA测序显示，与电针组相比，模型组miR-149-5p和miR-22-5p表达水平显著升高。KEGG和GO富集分析表明，这些miRNAs富集于与紧密连接相关的通路。用miR-149-5p或miR-22-5p mimics转染Caco-2细胞可增加单层通透性并下调紧密连接蛋白的表达。此外，注射AAV-miR-149-5p取消了电针对IBS-D大鼠的保护作用。

具体而言，电针显著提高了IBS-D大鼠的内脏疼痛阈值和OT%，降低了腹泻指数和血清二胺氧化酶（DAO）浓度，表明其有效改善了肠道屏障功能。组织学分析显示各组结肠组织均无显著病理改变，符合功能性胃肠病特征。qPCR和IHC结果证实电针下调了CRF/CRF-R1表达和肥大细胞活化标志物类胰蛋白酶的表达。TEM观察显示电针组肥大细胞超微结构正常，紧密连接完整，而模型组则出现分泌颗粒、线粒体肿胀和核周隙增宽等异常。

MC-EXOs的鉴定显示其呈碟形，表达CD9和CD81，平均直径为75.33 nm。测序和qPCR验证发现模型组MC-EXOs中miR-149-5p和miR-22-5p表达上调，而电针处理使其下调。体外实验证实过表达miR-149-5p或miR-22-5p可增加Caco-2单层通透性，降低ZO-1、Occludin和Claudin-1蛋白表达。体内实验进一步表明，AAV介导的miR-149-5p过表达逆转了电针的改善作用，导致肠道屏障功能受损。

讨论

本研究证明MC-EXOs携带的miR-149-5p调控了电针对IBS-D肠道屏障功能的改善作用。作为胃肠道的首道防线，肠道黏膜屏障在IBS-D研究中日益受到关注。心理应激显著影响肠道屏障完整性，在IBS-D发病机制中起关键作用。本研究采用的CUMS联合番泻叶溶液诱导的IBS-D大鼠模型成功模拟了IBS-D亚型的症状。

肥大细胞脱颗粒是其主要活化方式，在调节肠道屏障功能中至关重要。类胰蛋白酶在肥大细胞脱颗粒过程中分泌，对IBS-D大鼠肠道屏障完整性产生负面影响。CRF和CRF-R1的过度活化也与情绪和胃肠功能障碍有关。本研究团队先前发现电针抑制肥大细胞活化和CRF-R1表达，上调紧密连接蛋白表达，从而降低肠道通透性并促进屏障修复。使用CRF和肥大细胞激动剂后，电针的治疗效果显著减弱，表明电针的益处是通过抑制CRF/CRF-R1和肥大细胞活化介导的。

外泌体作为肥大细胞脱颗粒最具代表性的产物之一，是IBS发病的主要驱动因素。有趣的是，本研究发现在使用外泌体拮抗剂后产生的效果与电针治疗组相似，表明抑制外泌体释放可能复制电针的治疗效果。研究表明，IBS患者来源的外泌体可增加人结肠上皮细胞的通透性，突显其参与肠道屏障功能的调节。此外，外泌体已被提议作为传递针灸信号的潜在载体。值得注意的是，MC-EXOs参与神经免疫调节，被认为是针灸治疗作用的关键介质。这些发现进一步支持了MC-EXOs在电针治疗IBS中的关键作用。

大量研究表明，miRNAs通过调节紧密连接蛋白的表达来调节IBS肠道黏膜屏障功能。值得注意的是，miRNAs是MC-EXOs携带的关键生物活性分子，其在此形式下比其他形式更稳定。越来越多的证据表明，这些miRNAs参与肠道屏障功能的调节，并可能导致组织损伤。例如，肥大细胞来源的miR-223下调肠上皮细胞中CLDN8表达，从而损害屏障功能。总之，这些数据表明MC-EXO miRNAs导致IBS-D肠道屏障功能障碍。

MC-EXOs的高通量测序和qPCR分析均显示，模型组miR-22-5p和miR-149-5p表达水平显著升高，而在电针组降低。这些miRNAs富集于与紧密连接相关的通路，与本研究结果一致。为验证测序结果，研究利用Caco-2细胞系建立了肠上皮屏障的体外模型。发现用miR-149-5p和miR-22-5p mimics转染的细胞紧密连接蛋白表达降低，细胞通透性增加。miR-149-5p参与多种生理过程，包括细胞增殖和炎症反应。有证据表明miR-149-5p在调节紧密连接蛋白表达中起关键作用。更重要的是，miR-149-5p在IBS-D患者血清中显著上调，其水平极有可能受电针治疗调节。为探索miR-149-5p的体内作用，研究构建了AAV-miR-149-5p并注射给IBS-D大鼠。结果显示AAV-miR-149-5p注射取消了电针对肠道屏障的保护作用，进一步支持了MC-EXO miR-149-5p在电针介导的肠道屏障完整性恢复中的有害作用。

通路分析显示，差异表达miRNAs的预测靶点富集于“肌动蛋白细胞骨架的调节”，该通路直接影响紧密连接的组装。IBS-D患者结肠中细胞骨架成分水平降低。近期研究表明肥大细胞在调节细胞骨架中起关键作用。积累的证据表明电针可能在调节细胞骨架中起积极作用。此外，据报道miR-149-5p可能在调节细胞骨架中起关键作用。因此，这也将成为我们下一步研究的重点。

当前主要的IBS-D治疗方法包括5-HT₃拮抗剂和益生菌，但存在明显局限性。据报道5-HT₃拮抗剂可能通过造成屏障损伤增加缺血性结肠炎的风险。同样，虽然益生菌通常支持屏障功能，但特定菌株可能增加细胞旁通透性。我们的研究发现外泌体miR-149-5p的过表达通过上调关键紧密连接蛋白损害IBS-D肠道屏障功能。这种内源性机制具有独特优势，无神经系统副作用，可能通过纠正现有疗法的屏障损伤副作用与之协同作用，并其自然上调于人类IBS-D发病机制中 evidenced 生理相关性。

结论

MC-EXO miR-149-5p可能通过下调紧密连接蛋白的表达来调节电针对肠道屏障功能的恢复作用，是IBS-D的潜在治疗靶点。