NFYA1与GBF3协同调控CHS2促进柑橘橘皮素积累与抗冷性的分子机制

本研究揭示了柑橘中转录因子CiNFYA1和CiGBF3通过协同激活CiCHS2（Chalcone Synthase 2）启动子上的CCAAT和G-box（CACGTG）元件，正向调控橘皮素（tangeretin）生物合成，从而增强柑橘抗冷性的新机制。该发现深化了植物次生代谢物响应低温胁迫的转录调控网络认知，为利用代谢工程培育抗寒作物提供了关键靶点（如CiCHS2、CiNFYA1、CiGBF3）。

　　

2.1 橘皮素水平提升增强抗冷性

橘皮素作为一种多甲氧基黄酮，具有抗氧化特性，但其在植物非生物胁迫耐受性中的作用尚不明确。研究通过外源施加橘皮素处理柑橘植株，发现500 μM橘皮素预处理可显著提高内源橘皮素含量，并增强植株的冷耐受性。表型上，处理组叶片萎蔫程度减轻，叶绿素荧光成像显示更强的荧光信号和更高的Fv/Fm比值，同时电解质渗透率（EL）和丙二醛（MDA）含量降低。组织化学染色（DAB和NBT）进一步证实橘皮素处理减少了H₂O₂和O₂˙^?的积累。类似结果在柠檬中也得到验证，表明外源橘皮素 supplementation 能增强柑橘抗冷性。

2.2 CiCHS2受低温诱导并定位于内质网

转录组数据分析显示，CiCHS2（Ci190150）在低温下表达显著上调。RT-qPCR结果证实其在冷胁迫下的诱导表达模式。利用CiCHS2启动子驱动GUS报告基因的瞬时表达实验表明，低温处理可激活GUS活性。亚细胞定位显示CiCHS2-YFP信号与内质网标记蛋白HDEL-OFP完全共定位，表明CiCHS2定位于内质网（ER）。

2.3 CiCHS2通过调控橘皮素生物合成贡献于抗冷性

通过病毒诱导基因沉默（VIGS）技术敲低CiCHS2后，植株的CHS活性和橘皮素含量显著降低，冷耐受性减弱，表现为更严重的叶片损伤、更低的Fv/Fm比值、更高的EL和MDA水平以及ROS积累。外源橘皮素处理可部分恢复沉默植株的表型。利用CRISPR-Cas9技术构建的cichs2突变体也呈现类似冷敏感表型，且橘皮素积累减少。相反，在烟草中过表达CiCHS2可增强转基因植株的冷耐受性，提高CHS活性和橘皮素含量，降低ROS水平。这些结果证明CiCHS2通过促进橘皮素生物合成在调控抗冷性中发挥积极作用。

2.4 CiGBF3和CiNFYA1直接激活CiCHS2表达

酵母单杂交（Y1H）筛选发现CiNFYA1和CiGBF3可与CiCHS2启动子相互作用。点对点Y1H和电泳迁移率变动分析（EMSA）证实CiNFYA1和CiGBF3分别结合启动子上的CCAAT和G-box（CACGTG）元件，突变这些元件则结合消失。染色质免疫沉淀（ChIP）-qPCR显示CiNFYA1和CiGBF3在含有这些元件的启动子区域显著富集。双荧光素酶（LUC）报告系统检测证明CiNFYA1和CiGBF3可激活CiCHS2启动子驱动LUC表达，而突变元件则抑制该激活作用。这些结果表明CiGBF3和CiNFYA1作为转录激活因子直接调控CiCHS2表达。

2.5 CiGBF3和CiNFYA1通过调控CiCHS2介导的橘皮素合成正向调节抗冷性

过表达CiGBF3的烟草转基因植株表现出增强的冷耐受性，具有更高的CHS活性和橘皮素含量，更低的ROS水平。沉默CiGBF3则导致CiCHS2表达下调，橘皮素积累减少，冷敏感性增加，外源橘皮素处理可挽救该表型。类似地，沉默CiNFYA1也降低CiCHS2表达和橘皮素水平，削弱抗冷性。这些遗传证据表明CiGBF3和CiNFYA1通过正调控CiCHS2介导的橘皮素合成在冷胁迫响应中发挥关键作用。

2.6 CiNFYA1转录调控并与CiGBF3相互作用

Y1H、ChIP-qPCR和双LUC实验证明CiNFYA1可直接结合CiGBF3启动子上的CCAAT元件并激活其转录。双分子荧光互补（BiFC）和LUC互补成像（LCI）证实CiNFYA1与CiGBF3在体内外发生物理相互作用。共表达CiNFYA1和CiGBF3可协同增强对CiCHS2启动子的激活效应，表明二者形成异源二聚体协同调控下游基因表达。

3 讨论

本研究阐明了柑橘中一个由CiNFYA1-CiGBF3-CiCHS2组成的层级调控模块，通过精确转录调控介导冷诱导的橘皮素生物合成，从而增强抗冷性。低温胁迫上调CiNFYA1和CiGBF3表达，二者分别结合CiCHS2启动子特定元件独立激活其表达，同时CiNFYA1还可转录激活CiGBF3形成正向放大回路，且两者蛋白相互作用进一步强化对CiCHS2的转录激活。最终，CiCHS2表达上调促进橘皮素积累，通过清除ROS增强细胞稳态和冷耐受性。该发现不仅深化了对植物次生代谢物冷适应调控网络的理解，也为利用代谢工程靶向橘皮素合成途径培育抗寒作物品种提供了重要理论依据和基因资源。