Gal3-CaN-Smurf1复合物通过隔离FLCN-FNIPs调控TFEB激活以响应内膜损伤的机制研究

本文揭示了在溶酶体膜损伤条件下，Gal3（半乳糖凝集素3）作为损伤传感器，与CaN（钙调磷酸酶）和E3泛素连接酶Smurf1形成复合物，进而隔离FLCN（ folliculin）-FNIPs（FNIP1/2）复合物，破坏其对RagC-GAP活性的调控，从而抑制mTORC1介导的TFEB（转录因子EB）磷酸化，促进TFEB去磷酸化、核转位及激活。该发现为肿瘤进展（如Birt-Hogg-Dubé综合征）和耐药性提供了新的治疗靶点。

　　

2.1 Smurf1介导的TFEB核转位依赖于RagC失活

研究表明，Smurf1在响应溶酶体损伤时通过促进TFEB去磷酸化调控其核转位。实验证明，敲低Smurf1可增强TFEB磷酸化，而过表达Smurf1则降低其磷酸化水平，并在多种细胞系（如HEK293、LN229和U343）中验证了这一现象。免疫荧光显示，Smurf1敲低阻碍TFEB核转位，而过表达则促进该过程。进一步研究发现，Smurf1介导的TFEB激活依赖于RagC的失活：过表达RagC-GDP（活性形式）会抑制TFEB核转位并增强其磷酸化，且能阻断Smurf1对TFEB的去磷酸化作用。这表明Smurf1通过抑制RagC活性，解除mTORC1对TFEB的 cytoplasmic 滞留。

2.2 Smurf1促进RagC与TFEB的解离

TFEB通过其N端区域（1-44氨基酸）与Rag-Ragulator复合物（特别是RagA和RagC）相互作用。截断突变实验证实，TFEB的N端结构域（如1-250、1-319等）与RagA/RagC结合，而C端区域无此作用。点突变（TFEB-Q10A/L11A）显著降低其与RagA/RagC的结合 affinity。在氨基酸饥饿或mTORC1抑制剂Torin1处理下，TFEB定位于溶酶体膜；而过表达RagC-GDP或Smurf1可改变TFEB的亚细胞分布，表明Smurf1通过破坏TFEB-RagC相互作用促进TFEB核转位。

2.3 Gal3触发LLOMe诱导的FLCN-FNIPs隔离

溶酶体损伤标志物Gal3（而非Gal8或Gal9）在响应LLOMe时招募FLCN-FNIPs至溶酶体膜。LysoIP实验显示，LLOMe处理后FLCN-FNIPs和Gal3-CaN-Smurf1复合物共同富集于溶酶体膜。Gal3敲低显著减少FLCN-FNIPs的溶酶体定位，且该过程依赖Rag-Ragulator复合物（如p18）。免疫荧光证实Gal3与FLCN在LLOMe处理后共定位，表明Gal3在 initiating FLCN-FNIPs sequestration 中起关键作用。

2.4 Smurf1直接与FLCN互作并介导其泛素化

Smurf1作为E3连接酶，直接 ubiquitinates FLCN at K462 via K63-linked polyubiquitination。泛素化实验显示，Smurf1过表达增强FLCN泛素化，而Smurf1敲低或催化失活突变体（C699A）则抑制该过程。结构域 mapping 表明Smurf1的HECT结构域与FLCN的DENN结构域（345-485）相互作用。FLCN-K462R突变体减少其与Smurf1的结合，并部分恢复TFEB磷酸化，证明Smurf1介导的FLCN泛素化在调控TFEB激活中至关重要。

2.5 Gal3-CaN-Smurf1复合物与FLCN互作

Gal3、CaN（PPP3CB）和Smurf1均与FLCN直接相互作用：Gal3结合FLCN linker区域（202-344），PPP3CB结合FLCN DENN区域（486-528）。FLCN-K462R突变降低其与Gal3-CaN-Smurf1复合物的结合 affinity，并减弱其与Rag-Ragulator的互作。此外，Smurf1还 ubiquitinates FNIP2 at K466，进一步稳定FLCN-FNIPs复合物。这些互作共同促进FLCN-FNIPs在溶酶体损伤时的隔离。

2.6 Gal3-CaN-Smurf1复合物促进FLCN-FNIPs隔离

Gal3和PPP3CB分别与FNIP1/FNIP2的特定结构域互作：Gal3结合FNIP1 linker（575-901）和FNIP2 Longin（175-391）区域；PPP3CB结合FNIP1 FNIP_M（272-574）和FNIP2 Longin区域。这些互作在LLOMe处理后增强，形成稳定的 megacomplex，从而隔离FLCN-FNIPs并抑制其GAP活性。

2.7 FLCN-FNIPs隔离的结构基础

AlphaFold2模拟显示，Gal3-CaN-Smurf1复合物呈延伸结构（长约170?），其 groove（宽约35?）可容纳FLCN-FNIP2复合物（直径约86?）。Gal3 N端结构域（约80?）与FLCN-FNIP2环形结构匹配，表明该复合物通过空间位阻隔离FLCN-FNIPs，阻止其与Rag-Ragulator结合，从而抑制mTORC1对TFEB的磷酸化。

2.8 FLCN-K462R和FNIP2-K466R突变降低复合物稳定性

FLCN-K462R和FNIP2-K466R突变减弱其与Gal3-CaN-Smurf1复合物的结合，并减少溶酶体膜定位（基于TMEM192标记）。这些突变还破坏FLCN-FNIPs的稳定性，如FLCN-K462R降低其与FNIP1/FNIP2的互作，FNIP2-K466R降低其与FLCN的结合，证实泛素化修饰在维持复合物功能中的关键作用。

2.9 LLOMe增强Gal3-CaN-Smurf1与FLCN-FNIPs的互作

LLOMe处理显著增强Gal3与FNIP1的互作，以及FLCN与Smurf1的结合。体内外实验证实，Gal3、PPP3CB和Smurf1直接与FLCN或FNIPs互作：Smurf1结合FLCN，PPP3CB结合FNIP1，Gal3结合FLCN。这些互作在LLOMe后进一步加强，形成稳定的应激响应复合物。

2.10 Smurf1直接泛素化TFEB

Smurf1与TFEB的Pro-rich区域（含PPGY motif）互作，并介导其K431位点的K63-linked泛素化。该修饰促进TFEB与RagC的解离，从而增强其核转位。TFEB-K431R突变减少泛素化并增强其与RagC的结合，证实Smurf1通过泛素化调控TFEB的亚细胞定位。

2.11 FLCN-FNIPs稳定Gal3-CaN-Smurf1复合物

FLCN过表达增强Gal3、PPP3CB和Smurf1之间的互作，而FLCN敲低则破坏该复合物的稳定性。FNIP1/FNIP2同样促进复合物组装，如FNIP2过表达增强FLCN与Smurf1的结合。这表明FLCN-FNIPs不仅是被隔离的底物，更是复合物的稳定因子，形成正反馈调节 loop。

3.1 总结：内膜损伤中Gal3-CaN-Smurf1复合物隔离FLCN-FNIPs以激活TFEB

本研究揭示了一条 novel 通路：溶酶体损伤时，Gal3感知损伤并招募CaN和Smurf1，形成三元复合物。该复合物隔离FLCN-FNIPs，阻断其RagC-GAP活性，从而抑制mTORC1对TFEB的磷酸化。同时，Smurf1直接泛素化TFEB（K431）和FLCN（K462）/FNIP2（K466），促进TFEB核转位和 lysosomal biogenesis 相关基因表达。该机制在肿瘤细胞（如胶质瘤）中可能促进应激适应和耐药性，为靶向治疗提供新策略。

4 讨论

该研究阐明了溶酶体损伤下TFEB激活的双重调控：一方面通过CaN介导的去磷酸化，另一方面通过Smurf1介导的FLCN-FNIPs隔离和泛素化修饰。这与营养饥饿时的TFEB调控机制（如FLCN失活）既相似又 distinct，体现了细胞应对不同应激源的特异性。研究还提示，Gal3-CaN-Smurf1复合物可能作为“分子塞”稳定受损溶酶体膜，或参与 lysophagy 与ESCRT修复途径的 crosstalk。在肿瘤语境下，该通路的异常激活可能促进TFEB驱动的肿瘤生长和耐药，因此靶向Smurf1或FLCN-FNIPs或成为治疗新方向。