柬埔寨叶蝉及其寄生蜂（Dryinidae与Halictophagidae）的原生与次生共生菌特征及寄生调控作用研究

本研究通过16S rRNA基因测序，系统解析了柬埔寨六种叶蝉（Cicadellidae）及其寄生蜂（Dryinidae和Halictophagidae）的微生物群落，发现Sulcia为叶蝉优势共生菌，而寄生蜂微生物多样性更高；揭示了Wolbachia、Arsenophonus等次生共生菌在宿主-寄生蜂间的潜在传播，为农业害虫生物防治提供了新的微生物互作视角。

　　

1 引言

水稻叶蝉和飞虱作为重要的农业害虫，对经济和生态造成显著影响。它们传播多种植物病毒，如东格鲁病毒和水稻黄矮病毒，导致作物严重减产。叶蝉（半翅目：叶蝉科）是一类多样且广泛分布的植食性昆虫，作为植物病原体的传播媒介，其防控策略包括农业实践调整、农药施用和天敌生物防治。寄生作为一种共生形式，在宿主生态和进化中扮演重要角色，而寄生蜂（如Dryinidae和Halictophagidae）因其高特异性和致死效应，被广泛应用于农业生态系统的生物防治。

昆虫与微生物的共生关系日益受到关注，但这些互作在宿主-寄生蜂系统中的角色仍知之甚少。节肢动物携带多样的微生物共生体，影响其生物学功能、适应性和抗性。例如，叶蝉中的初级共生菌Sulcia（Candidatus Karelsulcia muelleri）为其提供必需氨基酸；而Wolbachia等次生共生菌除调控生殖外，还可能参与营养供给。微生物群落可能直接或间接影响寄生建立，暗示宿主、微生物和寄生蜂之间存在三重互作。尽管自由生活昆虫的宿主-微生物互作已有较多研究，但寄生蜂相关微生物，尤其是内寄生蜂（如Halictophagidae）和外寄生蜂（如Dryinidae）的微生物组成仍待深入探索。

2 材料与方法

2.1 站点与样本采集

样本采集自柬埔寨Kampong Speu省的Chambok社区生态旅游站点和洞里萨湖周围的五个地点，生境包括水稻田、竹林和退化森林。昆虫采样于2019年7月至2020年9月进行，使用扫网捕获并保存在95%乙醇中。标本存放于柬埔寨昆虫学倡议实验室进行分选和鉴定。

2.2 叶蝉与寄生蜂鉴定

基于形态特征鉴定了六种叶蝉：Cofana spectra、Exitianus sp.、Goniagnathus punctifer、Maiestas dorsalis、Nephotettix virescens和Stirellus sp.。通过解剖筛选出30只被寄生的叶蝉个体，根据可见的Dryinidae幼虫囊或Halictophagidae内寄生幼虫识别寄生状态，并选择30只未寄生个体作为对照。利用通用引物扩增COI基因进行物种确认，最终23只寄生蜂幼虫通过NCBI和BOLD数据库匹配被鉴定为Dryinidae或Halictophagidae。

2.3 DNA提取与扩增

在瑞典农业科学大学进行DNA提取，使用QIAamp DNA Mini Kit，并包含微生物群落标准品作为阳性对照。针对16S rRNA基因V3–V4区，使用引物341F和805R进行两步PCR扩增，寄生蜂样本采用巢式PCR以提高扩增效率。

2.4 测序与数据分析

测序文库制备使用SMARTer ThruPLEX DNA-seq Kit，在Illumina MiSeq平台上进行双端300 bp测序。原始数据经Cutadapt去接头和引物，使用DADA2流程进行质量过滤、去噪和ASV推断， taxonomic分类通过DECIPHER和SILVA数据库完成。数据分析在Phyloseq中进行，包括群落结构可视化和统计比较。

3 结果

3.1 宿主-寄生互作

共鉴定出九种寄生昆虫（Dryinidae和Halictophagidae）寄生六种叶蝉宿主，形成五个Dryinidae-叶蝉组（DCG）和四个Halictophagidae-叶蝉组（HCG）。Halictophagidae寄生五种叶蝉，而Dryinidae与三种叶蝉关联，其中Stirellus sp.和N. virescens被两类寄生蜂共同寄生。

3.2 细菌群落结构

测序共获得1,278,776条原始序列，过滤后保留1,163,804条 reads，最终生成300个ASVs。叶蝉宿主细菌群落以 Bacteroidota 门（主要为Sulcia）为主导，相对丰度达49.94%；寄生宿主中 Bacteroidota 占70.87%，Proteobacteria 占29.63%。在属水平，Sulcia（70.36%）、Nasuia（7.51%）和Wolbachia（6.18%）为最优势菌属。

Dryinidae寄生蜂群落包含7门细菌，以Proteobacteria（55.5%）和Firmicutes（26.68%）为主，优势科为Rhodobacteraceae和Comamonadaceae。Halictophagidae寄生蜂群落涵盖9门，Proteobacteria（77.56%）和Firmicutes（18.91%）占主导，Wolbachia在属水平最丰富（35.84%）。

3.3 叶蝉宿主-内共生菌关联

Sulcia作为专性共生菌存在于所有叶蝉样本中，但共生的初级和次生共生菌组成因物种而异。N. virescens中检测到Nasuia与Sulcia共存；Wolbachia在Exitianus和Goniagnathus中普遍存在。次生共生菌如Arsenophonus、Rickettsia和Sodalis也在多个宿主中被识别，其分布呈现互补模式，暗示功能协同。

3.4 寄生宿主与寄生蜂的细菌ASV共现

分析揭示部分ASV在宿主-寄生蜂对中共享，如Exitianus sp.与Halictophagidae（HCG2）共享Arsenophonus和Wolbachia ASVs；N. virescens与Dryinidae（DCG5）共享Diplorickettsia ASVs。这些共现表明潜在的水平传播或共同感染事件，但需进一步验证。

4 讨论

4.1 初级与次生内共生菌

Sulcia作为叶蝉的核心共生菌，为其提供必需氨基酸，与文献中其他吸汁性昆虫的报道一致。次生共生菌如Nasuia、Diplorickettsia、Rickettsia和Sodalis的出现，提示它们可能辅助Sulcia的营养功能，尤其在特定宿主背景下。Wolbachia的广泛存在暗示其可能超越生殖调控，扮演营养共生角色，但功能需实验确认。寄生蜂微生物群落较宿主更为多样，Dryinidae中Rhodobacteraceae和Comamonadaceae富集，Halictophagidae中Wolbachia占主导，反映其生态和进化差异。

4.2 寄生对微生物群的影响

尽管寄生未显著改变叶蝉整体菌群结构，但次生共生菌如Arsenophonus、Wolbachia、Diplorickettsia和Rickettsia在宿主-寄生蜂对中的共享，表明可能的水平传播。例如，Wolbachia ASVs在多个对中一致，且在某些寄生宿主中丰度升高，提示寄生事件可能促进其传播。Sodalis在Cofana spectra中的稳定存在，暗示其与宿主的持久共生而非短暂关联。这些发现强调了宿主-寄生蜂系统中微生物动态的复杂性，为农业害虫防控中的微生物互作提供了新见解。

本研究首次全面描述了柬埔寨叶蝉及其寄生蜂的微生物组成，揭示了Sulcia的核心地位和次生共生菌的多样角色，为后续功能研究和生物防治应用奠定了理论基础。