烘焙阿萨伊（Euterpe oleracea）种子升级再造饮料：通过胃肠道模拟评估其抗氧化能力与细胞保护作用

本研究系统评估了来自巴西不同产区的烘焙阿萨伊种子饮料的理化特性、酚类成分及抗氧化活性，并通过体外消化模型和Caco-2细胞实验揭示其消化稳定性与细胞保护机制（ORAC、DPPH、ABTS、FRAP等指标），为开发功能性无咖啡因饮品提供科学依据。

　　

2 Experimental Section

2.1 Sample Collection and Physical-Chemical Characterization

研究收集了来自巴西三个地区（北部、东北部和东南部）的六种商业化烘焙阿萨伊种子粉末样品。这些样品在水分、灰分、蛋白质、脂质、碳水化合物、水活度和pH值等方面存在显著差异。水分含量范围为1.52–5.30 g/100g，符合法规要求（≤5 g/100g）。脂质含量在5.09–12.22 g/100g之间，碳水化合物为主要成分（82.19–89.76 g/100g）。样品的酸性较强（pH 2.95–4.95），可能与原料来源和加工条件有关。

2.2 Elaboration of Percolated Beverage of Roasted A?aí Grains

采用1:10（w/v）的粉水比例，在100°C条件下通过渗滤法制备饮料，提取率达90%。饮料制备后冷藏保存以备后续分析。

2.3 Screening of Samples

通过Folin–Ciocalteu法测定总酚含量，北部地区样品为1.68–2.60 mg GAE/g，东北部样品为1.72 mg GAE/g，东南部样品为1.97 mg GAE/g。选择总酚含量最高的三个样品（N-AP代表北部，NE-PE代表东北部，SE-SP代表东南部）进行后续生物活性研究。

2.4 In Vitro Simulated Digestion

采用Infogest标准方法进行体外模拟消化，包括口腔、胃和肠三个阶段。消化液pH使用HCl或NaOH调节，并在37°C下孵育。每个阶段收集样本，离心后取上清液于-20°C保存。

3 Bioactive Evaluation Before and After Digestion (in vitro)

3.1 Total Flavonoids

采用Zhishen等方法测定总黄酮含量，结果以毫克儿茶素当量（EC）/克样品表示。

3.2 Condensed Tannins

使用Folin–Ciocalteu法测定缩合单宁，结果以毫克单宁酸当量（TAE）/克样品表示。

3.3 Diphenyl-1-Picrylhydrazyl (DPPH) Radical Scavenging Activity

通过Brand-Williams等方法评估DPPH自由基清除能力，结果以微摩尔Trolox当量（TE）/克样品表示。

3.4 Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC)

采用Re等方法测定ABTS自由基清除能力，结果以微摩尔Trolox当量（TE）/克样品表示。

3.5 Iron-Reducing Antioxidant Power (FRAP)

通过Benzie等方法评估铁离子还原能力，结果以毫克Trolox当量（TE）/克样品表示。

3.6 Oxygen Radical Absorbance Capacity—ORAC

评估样品对过氧自由基（ROO?）的清除能力，使用荧光素探针，结果以微摩尔Trolox当量（TE）/克样品表示。

4 Phenolic Profile

4.1 Determination of Phenolic Profile

采用高效液相色谱（HPLC）结合二极管阵列检测器（DAD）分析酚类化合物。共鉴定出19种酚类物质，包括7种酚酸、6种黄酮类、3种单宁、2种简单酚和1种富马酸。北部和东北部样品以香草酸、丁香酸和绿原酸为主，东南部样品则以表儿茶素没食子酸酯、咖啡酸和槲皮素-3-葡萄糖苷为特征。

4.2 Cytotoxic/Cytoprotective Assays (Caco-2 Cell Culture)

4.2.1 Culture and Maintenance Conditions of Caco-2 Cells

使用人肠上皮细胞系Caco-2，培养于DMEM培养基中，含10%胎牛血清和抗生素，在37°C、5% CO₂条件下培养。

4.2.2 Evaluation of Cell Viability With MTT Reduction Assay

通过MTT法评估细胞毒性。所有样品在500 μg/mL浓度下均未显示明显毒性（细胞存活率>90%），且在与H₂O₂共处理时表现出细胞保护作用。

4.2.3 Evaluation of ROS Production With DCF-DA Assay

使用DCF-DA荧光探针检测细胞内活性氧（ROS）水平。结果显示，样品能显著降低H₂O₂诱导的ROS生成，表明其具有抗氧化保护作用。

4.2.4 Statistical Analysis

所有实验数据均通过ANOVA和Tukey检验进行统计分析，显著性水平设为p ≤ 0.05。

5 Results and Discussion

5.1 Physicochemical Parameters of Roasted A?aí Grain Powders

样品的化学成分差异显著，可能与烘焙工艺缺乏标准化有关。北部样品脂质含量较高（最高达12.22 g/100g），而碳水化合物在所有样品中占主导地位（82.19–89.76 g/100g）。pH值较低（2.95–4.95），表明饮料具有较强酸性。

5.2 Bioactive Evaluation Before and After Digestion (In Vitro) of Percolated Beverages Made With Roasted A?aí Beans

5.2.1 Condensed Tannins and Total Flavonoids

消化后缩合单宁和总黄酮含量均显著增加，可能与酚类化合物从食物基质中释放有关。北部样品（N-AP）的单宁含量最高（5.72 mg/g）。

5.2.2 Antioxidant Activity

消化前，样品对DPPH和ABTS自由基的清除率分别为88%和96–98%，高于咖啡和绿茶。消化后，DPPH、ABTS和FRAP值下降，但ORAC值保持稳定（123–133%），表明部分酚类化合物在消化过程中仍保持活性。

5.2.3 Total Phenolic Content and Phenolic Profile

生阿萨伊种子总酚含量为20.04 mg GAE/g，消化后降至4.70 mg GAE/g。烘焙样品总酚含量较低（1.68–2.60 mg GAE/g），可能与热处理导致酚类降解有关。聚类分析显示，消化前后酚类 profile 发生显著变化，消化后儿茶素、原花青素A2和B1含量增加。

5.2.4 Principal Component Analysis

主成分分析（PCA）显示，PC1和PC2共同解释了77.29%的变异。北部和东北部样品在抗氧化活性（FRAP、ABTS、DPPH）方面表现相似，并与绿原酸、香草酸和丁香酸相关。

6 Cytotoxic/Cytoprotective Assays (Caco-2 Cell Culture)

6.1 Evaluation of Cell Viability With MTT Reduction Assay

所有样品均未显示细胞毒性（存活率>90%），且在氧化应激条件下（H₂O₂处理）仍能维持细胞活力。

6.2 Evaluation of ROS Production With DCF-DA Assay

样品能显著抑制H₂O₂诱导的ROS生成，其中东南部样品（SE-SP）表现最佳。这一作用可能与样品中的酚类化合物和美拉德反应产物（如 melanoidins）有关。

7 Concluding Remarks

烘焙阿萨伊种子饮料作为一种升级再造产品，具有丰富的酚类化合物和显著的抗氧化活性。体外消化后仍保持部分生物活性，并能有效保护肠道细胞免受氧化损伤。未来研究应优化烘焙工艺，并进一步开展体内实验以验证其健康益处。