表皮干细胞外泌体通过miR-200s/ZEBs轴诱导成纤维细胞间质-上皮转化缓解增生性瘢痕形成

本研究揭示了表皮干细胞外泌体（ESC-EVs）通过递送miR-200家族（miR-200s）靶向抑制ZEB1/2表达，诱导增生性瘢痕成纤维细胞（HSFs）发生间质-上皮转化（MET），从而抑制其活化并缓解纤维化的新机制。该发现为增生性瘢痕（HS）的精准治疗提供了新靶点和策略。

　　

引言

增生性瘢痕（Hypertrophic Scar, HS）是皮肤损伤后常见的愈合并发症，表现为成纤维细胞持续过度活化和增殖，导致细胞外基质（ECM）过度合成和胶原收缩。尽管现有治疗方法多样，但疗效均不理想。近年研究发现，上皮-间质转化（EMT）在组织纤维化和瘢痕形成中起关键作用，而逆转这一过程——即间质-上皮转化（MET）——可能成为治疗新策略。

表皮干细胞（Epidermal Stem Cells, ESCs）作为皮肤上皮细胞的重要祖细胞，在创面愈合和瘢痕重塑中发挥重要作用。其分泌的细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）携带多种生物活性分子，能够模拟ESCs的功能特性。本研究旨在深入探讨ESC-EVs诱导HS成纤维细胞（HSFs）MET的具体分子机制。

材料与方法

研究首先从人包皮和胎儿大鼠皮肤中分离培养ESCs和成纤维细胞（FBs），并通过流式细胞术鉴定其表面标志物（ESCs高表达CD49f和Krt15，FBs高表达Vimentin）。通过差速超速离心法分离ESC-EVs和FB-EVs，并采用透射电镜、纳米颗粒追踪分析和Western blot对其形态、粒径分布和标志物（Alix、CD9、CD81、CD63、TSG101）进行表征。

建立体外HSFs模型和体内大鼠尾部HS（RHS）模型。通过PKH67标记示踪EVs的细胞内化情况。采用CRISPR/Cas9系统构建miR-200家族（miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141、miR-429）敲减的ESC细胞系。通过qRT-PCR、Western blot、免疫荧光、荧光原位杂交（FISH）和多色免疫组化（mIHC）等技术检测相关分子表达。通过细胞划痕实验和胶原凝胶收缩实验评估HSFs的迁移和收缩能力。

结果

ESC-EVs的表征与内化

分离的ESC-EVs呈典型双层膜结构，平均粒径为127.9 nm，高表达外泌体标志蛋白，且能够被HSFs有效内化。

ESC-EVs诱导HSFs发生MET

ESC-EVs处理使HSFs形态向上皮样细胞转变，并显著下调间质标志物（COL1A1、α-SMA、N-cadherin）表达，同时上调上皮标志物（Krt1、Krt15、E-cadherin）表达，最佳有效浓度为5 μg/mL。

miR-200s是ESC-EVs中的关键效应分子

miRNA测序发现，miR-200家族成员在ESC-EVs中显著富集。生物信息学分析提示其潜在靶点为ZEB1和ZEB2。实验证实，ESC-EVs能将miR-200s递送至HSFs中，并显著抑制ZEB1/2的表达。

HS组织中存在miR-200s缺陷和ZEBs累积

与正常皮肤和成熟瘢痕相比，HS组织中miR-200s表达显著降低，而ZEB1/2蛋白水平显著升高。

ESC-EVs通过miR-200s/ZEBs轴诱导MET

利用多重CRISPR/Cas9系统敲减ESC中的miR-200s后，其来源的EVs失去诱导MET和抑制ZEB1/2表达的能力，同时HSFs的迁移和收缩能力恢复。

ESC-EVs在体内缓解HS形成

在大鼠RHS模型中，局部注射ESC-EVs可显著改善瘢痕的临床表现（厚度、体积、柔软度），降低瘢痕隆起指数（SEI）和胶原密度，并上调瘢痕组织中miR-200s和上皮标志物表达，下调ZEB1/2和间质标志物表达。

讨论

本研究首次阐明ESC-EVs通过递送miR-200s靶向抑制ZEB1/2，诱导HSFs发生MET，从而抑制其活化并缓解纤维化的新机制。该发现不仅深化了对HS发病机制的理解，也为开发基于ESC-EVs或miR-200s的HS精准治疗策略提供了坚实的实验依据和新的方向。

结论

ESC-EVs可通过其携带的miR-200s靶向抑制ZEB1/2表达，诱导HSFs发生MET，进而抑制其生物学功能并缓解HS。靶向miR-200s/ZEBs轴为HS及其他纤维化疾病的治疗提供了新思路。