靶向PRMT6调控破骨细胞糖代谢：骨折愈合治疗新策略

本研究揭示了PRMT6（蛋白质精氨酸甲基转移酶6）通过调控破骨细胞糖代谢过程影响骨折愈合的新机制。研究发现PRMT6缺失或抑制剂（EPZ020411）处理可显著抑制RANKL诱导的破骨细胞形成和糖酵解过程（关键酶PFKM/L、PKM、LDHA下调），同时降低NF-κB信号通路活化。体内实验证实PRMT6抑制剂能有效促进小鼠骨折愈合，表现为骨小梁面积增加和骨矿物质密度提升。该研究为骨折延迟愈合/骨不连治疗提供了新的靶向治疗策略。

　　

引言

骨折愈合障碍是骨科临床面临的重要挑战，其发生与衰老、慢性炎症和代谢异常等多种因素密切相关。破骨细胞作为由单核细胞融合形成的特殊细胞类型，在骨组织重建过程中发挥关键作用。近年研究发现，破骨细胞的异常活化是导致骨折愈合障碍的重要原因，而葡萄糖代谢在破骨细胞形成激活过程中扮演着核心角色。糖酵解作为细胞能量代谢的重要途径，不仅为破骨细胞提供必需的能量支持，还通过能量代谢转换机制调控炎症性破骨细胞的生成。

PRMT6作为一种蛋白质精氨酸甲基转移酶，通过甲基化修饰精氨酸残基调控蛋白质功能和稳定性。最新研究表明，PRMT6在糖代谢调控中具有重要作用，其缺失会导致PKM（丙酮酸激酶）、PFKM/L（磷酸果糖激酶）和LDHA（乳酸脱氢酶）等关键糖酵解酶表达显著降低，从而阻碍糖酵解进程。然而，PRMT6在骨折愈合过程中的作用尚未见报道。

材料与方法

本研究使用PRMT6基因敲除（PRMT6^-/-）纯系小鼠及同窝对照（PRMT6^+/+）小鼠进行实验。通过尾基因组DNA PCR进行基因型鉴定，所有小鼠在无特定病原体条件下饲养。

体外破骨细胞分化实验中，从小鼠股骨和胫骨获取骨髓源性单核细胞/巨噬细胞（BMMs），使用含25 ng/ml M-CSF和50 ng/ml RANKL的α-MEM培养基培养7天。采用不同浓度PRMT6抑制剂EPZ020411处理细胞，通过TRAP染色评估破骨细胞分化情况。

Micro-CT分析采用10 μm/像素分辨率，40 kV电压，250 μA电流参数扫描小鼠股骨样本，测量骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁分离度（Tb.Sp）和骨矿物质密度（BMD）等参数。

Western blotting使用RIPA裂解缓冲液提取总蛋白，检测PRMT6、CTSK（组织蛋白酶K）、C-FOS（细胞Fos蛋白）、MMP9（基质金属蛋白酶9）等蛋白表达。qRT-PCR通过2^-ΔΔCt方法计算NFATc1、DC-STAMP和PRMT6 mRNA相对表达量。

结果

PRMT6参与骨折愈合过程

通过RNA测序分析发现，骨折后三周与一周相比共有7731个差异表达基因（DEGs），其中4314个下调，3417个上调。热图分析显示PRMT6在骨折三周后骨组织中的表达显著降低。免疫组化染色证实，未骨折小鼠骨组织中PRMT6阳性区域几乎不可见，而骨折后7天和14天PRMT6表达随时间逐渐增加，但在骨折21天时呈现明显下降趋势。

在细胞水平上，RANKL诱导的BMMs中PRMT6蛋白水平在诱导0、3、5和7天随时间推移逐渐上调。这些结果证实PRMT6能够参与骨折愈合过程，其表达随时间变化，是骨折愈合过程中的关键调控基因。

PRMT6基因敲除促进骨折愈合

Micro-CT实验显示，骨折三周后PRMT6^-/-小鼠相比PRMT6^+/+对照组表现出更高的骨体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁骨矿物质密度（Tb.BMD），而骨小梁分离度（Tb.Sp）略有降低。

组织形态计量学染色分析进一步证实这些发现。HE染色显示PRMT6^-/-小鼠相比PRMT6^+/+小鼠骨小梁面积显著增加。SO-FG染色显示，PRMT6^-/-小鼠由软骨细胞发育而来的骨小梁面积显著增加。值得注意的是，在此过程中，PRMT6敲除后破骨细胞数量显著减少，表明PRMT6促进破骨细胞分化和活化。

糖酵解是影响骨折愈合过程的关键信号通路

RNA-seq主成分分析显示PRMT6敲除前后样本聚类显著，表明存在显著转录变化。共鉴定出461个差异表达基因（DEGs），其中253个上调，208个下调。GO富集分析显示这些DEGs在多种生物过程中显著富集，重点关注代谢调控和分子机制相关的GO术语。

KEGG显著性条形图中，成骨细胞分化信号通路影响强烈，而糖酵解/糖异生、NF-κB和HIF-1等信号通路也显著富集。差异峰分析显示，Prmt6^-/-与Prmt6^+/+骨折组织间介导糖酵解的HIF-1信号通路和破骨细胞分化KEGG通路富集因子最高。

考虑到HIF-1在介导糖酵解起始中的作用和在糖酵解/糖异生通路中观察到的富集，我们探索了PRMT6缺失如何影响骨折愈合期间的糖酵解。基因集富集分析显示PRMT6^-/-组糖酵解显著减少。Western Blot分析显示，RANKL刺激后PRMT6^-/-细胞中关键糖酵解酶（PFKM/L、PKM和LDHA）显著抑制。

基于先前研究了解到NF-κB是破骨细胞分化的关键信号通路，我们探索了其在PRMT6缺失情况下的激活情况。GSEA显示NF-κB信号通路在PRMT6^+/+样本中显著激活。Western Blot观察到相同结果，PRMT6^+/+细胞中RANKL刺激导致p65快速磷酸化。

PRMT6缺失抑制小鼠骨髓巨噬细胞破骨细胞分化和活化

Micro-CT扫描显示，未经任何干预的PRMT6^+/+小鼠相比PRMT6^-/-小鼠，PRMT6^-/-小鼠BV/TV、Tb.BMD显著升高。

实验观察到PRMT6^+/+小鼠BMMs中可形成大面积且发育良好的破骨细胞，具有显著的骨吸收活性。然而，PRMT6^-/-小鼠BMMs中破骨细胞显著抑制，表现为成熟破骨细胞面积小和骨吸收活性显著降低。此外，在PRMT6缺失情况下，破骨细胞相关蛋白CTSK和MMP9水平降低。

PRMT6抑制剂EPZ020411抑制小鼠骨髓源性巨噬细胞破骨细胞分化和活化

使用选择性PRMT6抑制剂EPZ020411进行实验。CCK-8检测显示，浓度低于15 μM时EPZ020411对BMMs不产生细胞毒性，因此选择0、5和10 μM药物浓度进行后续实验。

PRMT6抑制导致破骨细胞形成呈剂量依赖性减少，表现为破骨细胞数量和面积减少，以及骨吸收活性剂量依赖性显著降低。此外，在PRMT6抑制背景下，还导致破骨细胞相关蛋白CTSK和C-FOS水平降低，进而导致破骨细胞相关基因DC-STAMP和NFATC1表达下降。

PRMT6抑制剂EPZ020411加速骨折愈合过程

使用选择性PRMT6抑制剂EPZ020411构建骨折模型，连续给药7天，对照组注射PBS。Micro-CT检测显示，骨折三周后，注射抑制剂的小鼠表现出更高的骨体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁密度（Tb.BMD），且骨小梁分离度（Tb.Sp）相比PBS注射组显著降低。

组织学染色进一步证实先前结果。HE染色显示，注射EPZ020411的骨折组织相比注射PBS的骨组织骨小梁面积显著增加。SO-FG染色发现，PRMT6抑制时骨折组织软骨细胞面积相比未抑制时显著增加。有趣的是，TRAP染色发现PRMT6抑制情况下骨折早期破骨细胞数量反而增加。这种现象可能与骨折后炎症因子释放有关，包括TNF-α、IL-1β和IL-6等。这些细胞因子不仅参与炎症反应调控，还影响破骨细胞形成和活性。

讨论

骨折是骨科最常见和多发的疾病，全球5-10%骨折患者因各种因素遭受骨不连、延迟愈合和骨不连接等问题。因此，骨折后愈合障碍是创伤骨科的重要临床问题，其机制研究对临床骨折治疗策略具有重要意义。

骨折愈合是一个受多种信号通路调控的复杂系统，其中破骨细胞和成骨细胞之间的协同作用发挥核心作用。然而，越来越多研究表明，破骨细胞异常活化不仅加剧炎症反应，还阻碍骨折愈合。破骨细胞形成受多条通路调控，最著名的是NF-κB通路。但最新研究表明，葡萄糖代谢正成为影响破骨细胞生成的重要通路，因为破骨细胞生成所需的大部分能量由糖酵解提供，这是细胞在缺氧或低氧条件下获取能量的主要方式。

PRMT6作为一种参与蛋白质翻译后修饰的酶，主要通过精氨酸残基甲基化修饰调控蛋白质功能和稳定性。本研究通过转录组测序分析发现，PRMT6在骨折愈合过程中表达显著下调，表明其可能参与这一过程。进一步研究表明，PRMT6能够促进破骨细胞生成和活化，从而加速骨折部位骨吸收过程，进而影响后续骨再生。

此外，本研究发现PRMT6能够激活糖酵解过程，促进破骨细胞分化。具体而言，PRMT6表达上调能够增加糖酵解关键酶的表达和活性，从而加速葡萄糖分解代谢和能量产生。这一过程为破骨细胞分化和活化提供必要的能量支持。其中，PRMT6调控糖酵解关键酶的机制可能与HIF-1信号通路密切相关。HIF-1信号通路是介导糖酵解的关键通路，能够上调丙酮酸激酶等关键糖酵解酶。研究发现HIF-1信号通路表达水平在PRMT6^-/- BMMs中受到抑制，这表明PRMT6通过调控HIF-1信号通路影响破骨细胞糖酵解水平。

值得注意的是，糖酵解在破骨细胞分化中可能具有双重作用。一方面，糖酵解为破骨细胞分化提供必要的能量支持；另一方面，糖酵解过程中的代谢产物和信号分子也可能参与调控破骨细胞分化和功能。然而，过度糖酵解也可能导致炎症性破骨细胞的产生，这对骨折愈合不利。

为进一步研究PRMT6在骨折愈合中的作用，本研究构建了PRMT6缺失或抑制的小鼠模型，观察其对骨折愈合的影响。结果表明，PRMT6缺失或抑制显著抑制RANKL诱导的破骨细胞生成和糖酵解过程，从而减缓骨折部位骨吸收过程。这种效应有利于减少骨折部位的炎症反应和过度骨吸收，为后续骨再生和修复提供更好环境。因此，PRMT6缺失或抑制的小鼠在骨折愈合过程中表现出更快的愈合速度和更好的愈合质量。

结论

本研究通过转录组测序分析等方法揭示了PRMT6在RANKL诱导的破骨细胞生成和骨折愈合中的关键作用，并探索了其通过调控糖酵解影响破骨细胞生成和功能的机制。这一发现为骨折愈合和骨不连治疗提供了新的思路和靶点。未来研究将继续深入探讨PRMT6在骨折愈合中作用的具体机制，并探索靶向PRMT6的药物开发和临床应用前景。同时，还将关注其他可能影响骨折愈合的代谢通路和信号通路，旨在为骨折愈合及相关疾病治疗提供更全面和深入的认识。