巨细胞病毒暴露对结核病严重程度、细菌负荷、免疫反应及治疗结局的影响机制研究

本综述深入探讨了巨细胞病毒（CMV）暴露对结核病（TB）患者疾病严重程度、细菌负荷、免疫应答及治疗结局的显著影响。研究发现CMV血清阳性与更高的细菌载量（痰涂片等级）、更严重的肺部病变（双侧病变和空洞形成）及不良治疗结局风险增加相关，其机制涉及关键细胞因子（如IFN-γ、TNF-α、IL-10等）的调控异常，为TB的临床管理和免疫干预提供了重要依据。

　　

引言

结核病（TB）仍然是全球死亡的主要原因之一，每年约有1060万活动性病例和170万人死亡。此外，全球约四分之一的人口以潜伏形式携带结核分枝杆菌（Mtb），在合并感染等条件下可能发展为活动性TB。慢性病毒感染如人类免疫缺陷病毒（HIV）、丙型肝炎病毒和人类T淋巴细胞病毒1型均会增加TB患病风险。近期研究表明，人类巨细胞病毒（CMV）感染也会增加进展为TB疾病的风险。

CMV，也称为人类疱疹病毒5，是疱疹病毒科成员。CMV感染几乎无处不在，且在TB高负担地区流行。两种疾病在年龄和性别分布、地理流行异质性以及重叠风险因素方面具有相似的流行病学特征。在免疫正常宿主中，原发CMV感染通常无症状，但CMV可通过潜伏状态在宿主体内建立终身持续感染，并在免疫抑制情况下恢复为产毒性感染。CMV的感染、再感染和再激活可能广泛调节对TB的免疫应答。

Mtb的控制依赖于宿主的先天和适应性免疫应答，特别是Th1细胞介导的免疫，这对于抑制肺部巨噬细胞内的Mtb至关重要。Th1细胞因子如干扰素γ（IFN-γ）可激活巨噬细胞和细胞毒性T细胞以清除Mtb，而Th2细胞因子如白细胞介素4（IL-4）和IL-13则通过促进抗炎反应阻碍这一过程。尽管促炎细胞因子在TB免疫应答中起关键作用，但CMV暴露对TB细胞因子应答的影响尚未探索。

为填补这一知识空白，本研究旨在比较有或无CMV暴露的TB患者在疾病严重程度、细菌负荷和治疗结局方面的差异。此外，为探索CMV与TB相互作用的免疫学基础，我们检测了有或无CMV暴露的TB患者循环血浆中多种细胞因子和促纤维化因子的水平。

材料与方法

本研究经国立结核病研究所（NIRT）和Prof. M. Viswanathan糖尿病研究中心（MVDRC）伦理委员会批准。所有参与者均签署知情同意书，研究程序遵循机构伦理指南。

参与者来自印度南部金奈，作为2014年2月至2018年8月期间进行的前瞻性糖尿病对结核病严重程度影响（EDOTS）研究的一部分。研究纳入年龄25至73岁、新诊断且痰涂片和培养阳性的成年个体。排除标准包括既往TB发作、既往TB治疗、耐药TB、HIV阳性、使用免疫抑制药物、妊娠和哺乳期。采用标准化技术获取人体测量学（身高和体重）和生化参数。所有样本在DxH 520血液分析仪（贝克曼库尔特）上进行全血细胞计数。低体重指数（LBMI）根据美国心脏协会/美国心脏病学会指南定义为LBMI ≤ 18.5 kg/m²，超重定义为体重指数（BMI）25-29.9 kg/m²，肥胖定义为BMI ≥30.0 kg/m²。根据美国糖尿病协会标准，糖尿病定义为糖化血红蛋白（HbA1c）读数≥6.5%且空腹血糖≥126 mg/dl。采用胸部X光评估双侧肺部疾病和空洞病变，并由两名独立放射科医师读取。痰涂片等级用于测量TB个体的细菌负荷，分为0、1+、2+和3+，其中0表示显微镜下无细菌，3+表示细菌数量最多。实验室研究人员对胸部X光和细菌学结果设盲。所有招募的TB患者根据世界卫生组织建议通过直接观察治疗短程疗法（DOTS）接受抗TB治疗，由国家结核病消除规划（NTEP）监测。随访延长至治疗6个月和治疗完成后1年。治疗结局定义为有利或不利。有利治疗结局（治愈）定义为治疗第5和第6个月时痰培养阴性且随访期间无复发疾病。不利治疗结局包括治疗失败（第5或第6个月时痰培养阳性）、全因死亡率或初始治愈后12个月内TB复发。这些参与者未接受任何CMV治疗。通过酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（MyBiosource）检测血浆样本中免疫球蛋白G（IgG）滴度值来确定CMV血清状态。指数值<0.90为阴性，0.90至1.1为中间，>1.1为阳性。

使用多重Luminex检测（Magpix平台）（Bio-Rad Laboratories, Inc.）测量循环血浆细胞因子和促纤维化因子水平。测量的分析物包括细胞因子（干扰素（IFN）-γ、白细胞介素（IL）-2、肿瘤坏死因子（TNF-α）、IL-4、IL-5、IL-6、IL-13、IL-3、IL-7、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1Ra、IL-17、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、IL-12、IL-15、IL-10、IL-25、IL-33）和促纤维化因子（血管内皮生长因子（VEGF）、表皮生长因子（EGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）-AB、PDGF-AB/BB和颗粒酶B）。实验按照制造商说明（R&D Systems）进行。

分析前彻底检查数据的完整性和一致性。使用Shapiro-Wilks检验检查连续变量的正态性，发现不符合正态分布。数据使用频率、百分比、中位数和四分位数表示。几何平均数（GM）用于集中趋势测量。三组间统计学显著差异通过Kruskal-Wallis检验与Dunn事后多重比较分析。两组间使用Mann-Whitney U检验与Holm多重比较校正。组间连续变量差异使用Wilcoxon秩和检验检验，而组与因素（如痰涂片等级、双侧肺部病变、空洞病变以及TB治疗失败和复发）之间的关系使用Pearson卡方检验检验。使用具有二项回归和对数连接函数的广义线性模型来识别关键因素。回归模型的协变量选择基于数据可用性、相关文献回顾和主题专家意见。计算患病率比（PR）和调整后患病率比（aPR）以及相应的95%置信区间（CI）。具有显著PR的协变量在调整aPR时被考虑。使用STATA软件15.0版（StataCorp., Texas, USA）进行数据分析，所有P值均为双侧，统计学显著性设定为0.05 α水平。

结果

研究人群特征

总研究人群为422名肺结核（PTB）个体，包括172名CMV阳性、108名CMV中间和142名CMV阴性。CMV阳性者的中位年龄为44.0岁（四分位距[IQR], 36.0–51.5），CMV中间者为45.0岁（IQR, 36.0–52.0），CMV阴性者为45.0岁（IQR, 36.0–52.0）（P=0.003）。组间在性别、BMI或酒精使用方面无显著差异。然而，在年龄、吸烟、HbA1c和贫血方面观察到显著差异。与CMV阴性受试者相比，CMV阳性和CMV中间个体的淋巴细胞水平显著降低。

TB个体中临床合并症与CMV的关联

两组在年龄、性别、BMI、酗酒或HbA1c方面未观察到显著差异。然而，在吸烟和贫血方面注意到显著差异。有CMV暴露的吸烟个体的PR为1.57（95% CI: 1.16–2.80; p = 0.02），且在调整可能的混杂因素后，该关联仍然显著（aPR, 1.40, 95% CI: 1.09–1.96; p = 0.04）。有CMV暴露个体的贫血PR为2.69（95% CI: 1.19–4.70; p = 0.01），且在调整可能的混杂因素后，该关联仍然显著（aPR 1.82, 95% CI: 1.09–3.86; p = 0.04）。

CMV血清阳性与增加的影像学TB疾病严重程度和更大细菌负荷相关

CMV血清阳性与空洞疾病风险增加显著相关（PR, 6.31; 95% CI, 3.12-10.42; p < 0.001）和双侧肺部病变（PR, 5.24; 95% CI, 2.91-6.91; p< 0.001）。调整混杂变量后，CMV血清阳性仍然与较高的空洞风险显著相关（aPR, 4.21; 95% CI, 1.98-6.24; p < 0.001）和双侧肺部病变（aPR, 2.97; 95% CI, 1.71-5.17; p< 0.001），表明CMV暴露个体TB疾病严重程度增加。此外，CMV血清阳性与较高痰涂片等级风险升高显著相关（PR, 6.31; 95% CI, 3.12-10.42; p< 0.001）。调整混杂因素后，该关联仍然存在，CMV血清阳性仍然与痰涂片等级增加显著相关（aPR, 4.14; 95% CI, 2.21-7.16; p< 0.001），表明CMV暴露的TB患者细菌负荷更高。

CMV血清阳性与不利TB治疗结局风险增加相关

CMV血清阳性与不利治疗结局风险增加显著相关（PR, 1.67; 95% CI, 1.26–2.95; p = 0.01）。即使在调整混杂变量后，该关联仍然存在，CMV仍然与不利治疗结局显著相关（aPR, 1.48; 95% CI, 1.08-2.69; p = 0.05）。这些发现表明CMV阳性TB患者治疗失败或TB复发风险升高。

CMV血清阳性与TB中细胞因子和促纤维化因子水平改变相关

为探索CMV影响TB个体的可能机制，我们测量了CMV阳性、中间和阴性组TB个体多种细胞因子和促纤维化因子的血浆水平。IL-3、IL-7、IL-4、IL-5、IL-6、IL-1Ra、IL-17、GM-CSF、IL-12、IL-15、IL-25、IL-33、IL-13、EGF、PDGF-AA、PDGF-AB BB和颗粒酶B的循环水平在组间无显著差异。然而，与无CMV个体相比，CMV阳性和CMV中间TB个体的促炎细胞因子（IFN-α、IFN-β、G-CSF）、调节性细胞因子（IL-10）和促纤维化因子（VEGF）显著升高。相反，与无CMV个体相比，CMV阳性和CMV中间TB个体的1型细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-2）和促炎细胞因子（IL-1α和IL-1β）的循环血浆水平显著降低。

讨论

TB管理依赖于理解与疾病进展和抗TB治疗不良结局相关的 predisposing 因素。越来越多的证据表明合并感染在TB发病机制中的作用，因为慢性病毒感染已被证明在实验条件下促进Mtb、延迟Mtb特异性T细胞启动并导致TB发病率。其中，CMV感染最近被认为是TB疾病的潜在风险因素。美国国家健康与营养检查调查（NHANES）的一项大型横断面研究发现，CMV血清阳性与潜伏性TB感染（LTBI）独立相关，较高的CMV抗体水平与LTBI患病率增加相关，表明CMV诱导的免疫激活与TB易感性之间存在免疫学联系。然而，尽管证据不断增加，只有少数已发表的研究调查了两种感染之间的关联，并且导致TB易感性的机制尚不清楚。我们的研究首次探索了CMV暴露对TB疾病严重程度、细菌负荷和治疗反应的影响。

我们在一个由422名PTB患者组成的队列中检查了CMV暴露对临床特征、疾病严重程度和治疗结局的影响，根据CMV血清状态分为CMV阳性、CMV中间和CMV阴性组。我们的研究结果显示，与CMV阴性个体相比，CMV阳性和CMV中间个体的淋巴细胞计数显著降低。尽管在年龄、性别和BMI等人口统计学特征方面未观察到显著差异，但分析确定吸烟和贫血是与CMV暴露显著相关的临床合并症。调整后的患病率比表明，吸烟和贫血与TB患者CMV阳性独立相关，突出了在评估CMV暴露个体的TB疾病严重程度和结局时需要考虑这些因素。这与最近的发现一致，表明CMV血清状态与有重度吸烟史和贫血的个体相关。

此外，我们的结果表明，CMV暴露与增加的影像学TB疾病严重程度显著相关，证据是CMV阳性个体与CMV阴性个体相比，空洞疾病和双侧肺部病变的患病率更高。调整潜在混杂因素后，CMV阳性个体中空洞疾病和双侧肺部病变的患病率仍然显著升高。此外，CMV阳性与这些患者更高的细菌负荷相关，如痰涂片等级所示。调整混杂因素后这些关联的持续性强调了CMV暴露在加剧TB病理中的潜在作用，可能通过调节宿主免疫应答，从而促进Mtb复制和传播。一项涉及38,618名患者的15项研究的荟萃分析支持这一点，证明CMV感染与活动性TB风险增加显著相关（OR: 3.20; 95% CI: 2.18–4.70），CMV抗体水平与TB风险之间存在明显的剂量反应关系。来自最近一项纵向队列研究的进一步证据表明，在婴儿和青少年队列中，CMV特异性IFN-γ应答与CD8+ T细胞激活和TB疾病风险增加相关，以及更短的TB诊断时间，支持CMV诱导的免疫激活与TB易感性之间的联系。此外，一项发育中的TB疫苗的2b期临床试验发现，以CD4+ T细胞上HLA-DR表达增加为特征的免疫激活与南非婴儿TB疾病风险较高相关，强调了免疫激活（可能由CMV驱动）如何影响TB疾病进展。

CMV血清阳性与不利TB治疗结局的关联尤其令人担忧，因为它与治疗失败或TB复发风险较高显著相关，即使在调整混杂因素后也是如此。CMV可能通过对保护性免疫功能的持续影响导致TB患者治疗反应差。鉴于印度人群中CMV的高血清阳性率以及我们在此提出的发现，应考虑将CMV抗体筛查作为TB患者疾病严重程度的标志物和治疗结局的预测指标。

疾病严重程度和不利TB治疗结局的生物标志物在识别新型TB干预策略方面可发挥主要作用。由于细胞因子在宿主防御分枝杆菌感染中至关重要，并作为活动性TB疾病严重程度和细菌负荷的标志物，我们探索了反映TB感染中细胞介导免疫的细胞因子应答。已知CMV会失衡系统性细胞因子、T细胞和巨噬细胞应答以及炎症。我们的研究结果显示，CMV血清阳性TB与保护性细胞因子水平降低、促炎细胞因子改变和促纤维化因子升高相关，可能加剧TB发病机制。

人类观察队列和动物模型中的研究已确定，Th1细胞因子如IFN-γ、TNF-α和IL-12对于预防TB感染和疾病进展至关重要。TNF-α尤其重要，因为它通过激活吞噬细胞和肉芽肿形成在Mtb感染期间控制细菌。我们的研究结果表明，CMV血清阳性TB患者表现出较低的循环Th1细胞因子水平，表明存在驱动更严重TB的免疫学机制。此外，CMV阳性个体中IL-1水平降低与先前关于TB-HIV合并感染中免疫抑制的报道一致。I型干扰素（IFN-α和IFN-β）对病毒感染具有保护作用，可能在TB中产生有害影响。我们观察到CMV阳性个体中I型干扰素升高，与将I型干扰素升高与小鼠模型和人类不良TB结局相关的报道一致。慢性病毒感染，包括CMV，也可以增强免疫抑制因子如IL-10的产生，这会降低对Mtb的免疫保护并促进Mtb持续存在。新兴证据表明，CMV可能通过免疫抑制机制损害肺部的局部免疫应答，包括病毒IL-10介导的单核细胞向抗炎巨噬细胞表型极化，可能损害感染部位的Mtb控制。阻断IL-10已被证明可以稳定细菌负荷并提高Mtb感染小鼠的存活率。我们的数据支持这些发现，显示CMV阳性个体中IL-10水平升高，这可能加剧TB感染，如在转基因小鼠模型中观察到的那样。此外，我们注意到CMV阳性个体中血管内皮生长因子（VEGF）水平升高，这是一种与TB疾病严重程度和细菌负荷相关的生物标志物，证实了早期关于TB患者全身VEGF升高与广泛疾病受累的研究。

在本研究中，对几个变量进行了严格控制，包括年龄、性别、BMI、糖尿病、吸烟状况和酒精使用，这些已知会影响细菌负荷和疾病严重程度。由于吸烟状况和贫血在CMV阳性和CMV阴性组之间不同，我们调整了它们的影响，并证明尽管存在这种差异，CMV暴露与TB的显著关联仍然存在。因此，我们的研究证明了CMV血清阳性与空洞和双侧肺部病变风险增加之间的重要关联，即使在严格的筛查标准下。这些结果证实了其他研究表明这些病变对患者有不利影响，并可能导致不良治疗结局、复发和耐药性。根据PTB中的痰涂片等级估计，我们的数据证实了CMV血清阳性状态与分枝杆菌负荷的重要关联，这是传播风险和疾病严重程度的关键指标。我们的数据进一步证实，CMV暴露的TB个体经历不利治疗结局（包括治疗失败或TB复发）的风险显著更高。这一发现与先前的研究一致，表明TB-HIV合并感染患者表现出不良治疗结局和更高程度的炎症扰动。

我们的研究存在仅依赖IgG阳性作为CMV暴露诊断的局限性。结果提供了测量病毒载量的强烈理由，但这在可用样本中不可能，需要新的前瞻性研究。我们研究的另一个局限性是细胞因子水平在组间表现出很大程度的重叠，并且同一组中不同个体的反应存在变异性。本研究中未检查的其他因素可能导致了差异反应。这种变异性可能限制使用细胞因子水平作为预测性生物标志物，但通过统计调整，并不 diminish 其作为潜在生物过程信息标志物的价值。

总之，本研究强调了CMV与TB疾病之间复杂的相互作用，表明CMV暴露导致TB疾病严重程度增加、细菌负荷更大以及不利治疗结局风险更高。未来的研究应侧重于阐明CMV介导的TB免疫发病机制改变的机制，并探索潜在的治疗干预措施。