EM菌肥与有机肥配施调控高寒矿区人工草地植被-土壤-细菌互作网络的机制与生态效应研究

本研究系统探讨了EM菌肥与有机肥协同施用对高寒矿区人工草地植被群落特征、土壤理化性质及细菌群落多样性/功能结构的调控作用。关键发现包括：Y2E2处理（EM菌肥600 kg/ha + 有机肥20 t/ha）显著提升土壤全氮（TN）、有机质（SOM）含量，降低pH和电导率（SEC），并提高生物量；该处理同时优化土壤细菌群落结构，增加Shannon、Ace、Chao1指数，增强微生物共现网络正相关性（67.11%）。研究揭示土壤pH是细菌群落构建的关键驱动因子，协同施肥通过调节微生态功能（如锰氧化、光合作用）加速高寒矿区生态恢复。

　　

1 引言

位于祁连山南麓的木里矿区作为黄河支流大通河的发源地，长期露天开采导致植被退化、土壤结构破坏，形成大范围裸露矿渣区，严重威胁区域生态安全及草地畜牧业可持续发展。高寒矿区生态修复已成为迫切任务，而人工草地建植是重要途径。然而，土壤有机质含量低、微生物活性差等限制因子严重阻碍植被恢复。传统化肥虽可短期提高土壤肥力，但伴随土壤酸化、板结及微生物多样性下降等问题，难以实现可持续恢复目标。因此，研究可调控土壤微生物群落的绿色施肥技术成为解决高寒矿区生态修复难题的重要突破口。

EM菌肥与有机肥协同修复技术因其生态相容性和功能协同性受到广泛关注。EM菌肥含80多种功能微生物群，包括光合细菌、乳酸菌和放线菌等，通过有机物分解、养分活化和微生态调节等多途径调控根际微生物过程，进而改善土壤环境并影响植物生长。现有研究多集中于平原农业生态系统，且不同区域的养分添加量存在显著差异。高寒矿区尚无统一的菌肥与有机肥配施范围，而施肥对草地的影响可能存在响应阈值，过量施肥可能导致生产力增长减缓、物种减少、生物多样性下降等现象。因此，基于有机肥施用量配施不同剂量菌肥，确定最佳养分添加水平，对避免资源浪费、提高经济效益及维持高寒矿区草地生态系统稳定和促进可持续发展具有重要作用。

2 材料与方法

2.1 研究区概况

研究区位于青海省天峻县木里镇，平均海拔4200米，属半干旱高原气候，寒冷季节长达7–8个月，昼夜温差大。年平均日照2160 h，年平均气温-5.3 °C，年平均降水量626 mm，生长季仅120天。土壤为高寒草甸土，含大量煤矸石和岩石碎片，土壤全氮含量1.05 g kg^?1，全磷含量0.84 g kg^?1，有机质含量60.34 g kg^?1，电导率19090 μS cm^?1，pH 8.50，含水量15.0%。原生植被类型为高寒草甸，优势种包括小薹草、阿拉套薹草和垂穗披碱草。

2.2 实验设计

所用微生物菌肥为复合有效微生物（EM）菌肥，含芽孢杆菌、光合细菌、酵母菌和乳酸菌等关键功能微生物群（有效活菌数≥1.0×10⁸ CFU g^?1）。生物有机肥为矿源腐植酸型，有机质≥40%，N+P?O?+K?O≥5.0%。供试草种包括青海中华羊茅、青海肯塔基蓝草、青海冷地早熟禾和同德短芒披碱草，纯度≥92%，发芽率≥85%。

2022年5月5日，将供试牧草种子按18.0 g m^?2的播种量混匀条播。2023年6月初施肥，2024年同期重复，连续两年。根据团队前期研究成果、施肥指南和本底土壤条件，设有机肥施用量1.00、2.00、3.00 kg m^?2和EM菌肥施用量45.00、60.00、75.00 g m^?2的9个处理组，对照组（CK）不添加有机肥和EM菌肥。每个试验小区面积20 m²（4 m×5 m），小区间距2 m。9个施肥处理和1个CK处理为一个区组，区组间距30 m，设3个重复区组，共30个试验小区。

2.3 植被调查与土壤采样

2023年9月和2024年同期进行植被高度、盖度、密度和生物量调查。每个试验小区内随机设置5个0.5 m×0.5 m的样方，用卷尺（1 mm精度）测量每种草5株个体的平均高度，计数样方内所有茎秆数计算植物密度，采用点截法确定群落盖度。地上生物量通过齐地面收割植被，105 °C烘30 min后65 °C烘48 h至恒重称量。

同步采集土壤样品，用5 cm直径土钻按五点混合采样法取0–10 cm土样。每个小区混合一个土样，分三部分：一份阴干用于测定土壤有机质（SOM）、全氮（TN）和全磷（TP）含量；一份湿土-20 °C保存，测定土壤质量含水量、pH和电导率（SEC）；一份湿土-80 °C超低温保存，用于土壤微生物多样性分析。

2.4 测量与方法

2.4.1 土壤理化性质

土壤电导率（SEC）、土壤含水量（SWC）、pH、土壤有机质（SOM）、全氮（TN）和全磷（TP）的测定遵循《土壤农业化学分析》（第三版）规程。

2.4.2 土壤细菌DNA提取、PCR扩增与测序

土壤样品由上海美吉生物医药科技有限公司测序。用引物338F和806R扩增细菌16S rDNA的V3–V4区，分析平台为Illumina MiSeq PE300。工作流程包括：土壤总DNA提取、基因组DNA质控、PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳验证（1%）、PCR产物纯化、MiSeq文库构建、MiSeq文库质控、Illumina MiSeq平台测序。测序后原始数据用QIIME2平台（v2020.6）处理，将序列与SILVA数据库比对。首先在97%一致性下对所有样本的有效标签进行OTUs（操作分类单元）聚类，随后对OTUs序列进行分类注释。

2.5 数据分析与可视化

用Microsoft Excel 2016整理数据。植物群落特征和土壤理化性质用IBM SPSS Statistics 22.0进行单因素方差分析（ANOVA），数据以均值±标准差（SD）表示，统计显著性设为p<0.05。用Levene检验方差齐性。土壤细菌群落可视化分析（包括Venn分析、丰度分析、LEfSe统计分析、多样性分析、聚类分析和FAPROTAX功能预测）通过美吉云平台进行。用QIIME 2软件绘制稀疏曲线、物种相对丰度图、PCoA图（Bray–Curtis）、层次聚类树，并计算α多样性指数（包括OTUs、Shannon指数、Simpson指数、Pielou指数、Chao1指数和ACE指数）。用R软件（3.3.1版）绘制α多样性箱线图。为探究分组样本间群落结构差异，用LEfSe统计分析检测物种组成和群落结构的显著差异。应用FAPROTAX工具预测和分析生态样本中微生物群落功能。基于Spearman相关系数（|r|>0.6, p<0.05）进行网络分析，用NetworkX（1.11版）构建单因子相关网络图。用R软件（3.5.2版）生成环境因子、土壤理化性质与微生物多样性间的相关热图。用Canoco 5.0进行环境因子、土壤理化性质与土壤微生物多样性的冗余分析（RDA）。

3 结果

3.1 菌肥与有机肥配施对土壤理化性质的影响

菌肥与有机肥配施显著提高了土壤含水量（SWC）和养分水平（碳、氮、磷），同时降低了土壤pH和电导率（SEC）。第二年（2023年），Y2E2处理的土壤含水量（SWC）为26.27%，显著高于CK处理（p<0.05），增幅77.50%。Y2E2处理的土壤电导率（SEC）最低（818.33 μS cm^?1），较CK显著降低58.53%（p<0.05）。Y2E2处理的pH值降至8.05，显著低于CK处理（p<0.05）。土壤有机质（SOM）、全氮（TN）和全磷（TP）含量均在Y2E2处理达到峰值，分别为253.09 g kg^?1、7.50 g kg^?1和2.40 g kg^?1，较CK显著增加72.72%、68.92%和81.82%（p<0.05）。

第三年（2024年），土壤性质变化趋势与第二年一致，且改善效果更显著。Y2E2处理中，土壤含水量（SWC）进一步增至28.12%，土壤电导率（SEC）降至714.00 μS cm^?1，均与CK处理有显著差异（p<0.05）。pH值显著降至7.84，进一步接近中性条件。Y2E2处理的土壤有机质（SOM）、全氮（TN）和全磷（TP）含量分别达261.44 g kg^?1、7.74 g kg^?1和2.45 g kg^?1，较CK处理显著增加100.60%、76.31%和92.91%（p<0.05）。

3.2 菌肥与有机肥配施对土壤细菌群落的影响

3.2.1 土壤细菌16S测序结果质量分析与OTU数量变化

当序列提取数达5000时，不同处理组的稀疏曲线随样本量增加而趋于平缓（30000 reads稀疏阈值），表明当前测序数据量接近饱和，测序深度设置合适。Venn分析显示，10个处理组共检测到2549个细菌OTUs，其中Y2E3和Y2E2处理的OTU数最高，分别为2501和2481个，CK处理为2459个。10个处理组共享2042个OTUs，占总OTUs的80.11%，表明不同处理组细菌群落组成相似度高，独特OTUs分布有限。

3.2.2 土壤细菌群落组成与相对丰度变化

不同施肥处理下前30个土壤细菌门的相对丰度显示，优势门包括假单胞菌门（Pseudomonadota）（28.71–35.91%）、放线菌门（Actinomycetota）（0.09–16.35%）、酸杆菌门（Acidobacteriota）（9.11–12.16%）、绿弯菌门（Chloroflexi）（6.91–12.07%）、厚壁菌门（Bacillota）（7.82–12.63%）和拟杆菌门（Bacteroidota）（7.60–11.85%），在10个处理中相对丰度始终最高。CK处理与9个施肥处理间土壤细菌门的相对丰度存在显著差异。与CK相比，Y2E2和Y2E3处理增加了放线菌门和酸杆菌门的丰度，降低了假单胞菌门的丰度。

属水平上，鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）（2.61–4.48%）、norank_f__Vicinamibacteraceae（1.76–33.04%）、norank_f__A4b（1.46–2.76%）、norank_o__Vicinamibacterales（1.73–2.74%）、节杆菌属（Arthrobacter）（1.32–4.60%）和德沃斯氏菌属（Devosia）（1.42–2.42%）表现出较高丰度。进一步分析显示，与CK处理相比，Y2E2和Y2E3处理增加了norank_f__Vicinamibacteraceae的丰度，降低了德沃斯氏菌属的丰度。

3.2.3 土壤细菌群落的LEfSe分析

LEfSe分析确定了10个处理中细菌群落差异的最显著指示物种（LDA得分>3.0）。10个处理的细菌群落共检测到98个生物标志物（Y2E2中8个，其他处理各10个）。在分类水平上，CK、Y1E1、Y1E2、Y1E3、Y2E1、Y2E2、Y2E3、Y3E1、Y3E2和Y3E3处理的最高得分生物标志物分别为f__norank_o__Chloroplast、f__Devosiaceae、c__Bacteroidia、c__Polyangiia、g__Castellaniella、g__norank_f__Rhodanobacteraceae、f__Nostocaceae、c__Gemmatimonadia、p__Chloroflexota和g__Arthrobacter。

3.2.4 土壤细菌群落多样性分析

10个处理间土壤细菌群落α多样性指数存在显著差异。Y2E2处理的OTU数、Shannon指数、Ace指数和Chao1指数最高，分别为2254、6.60、2379.10和2384.80，较CK处理增加8.37%、2.36%、6.44%和5.05%，其中OTU数和Ace指数达显著水平（p<0.05）。Pielou指数在Y1E2处理达最大值（0.86），Y2E2处理次之（0.85），较CK增加1.77%和1.30%。10个处理中，Simpson指数值从高到低排序为：Y3E3 > CK > Y2E3 > Y1E3 > Y1E1 > Y1E2 > Y3E2 > Y3E1 > Y2E2 > Y2E1，Y2E2和Y2E1处理的Simpson指数值最低。总之，EM菌肥与有机肥配施显著增强了土壤细菌群落的α多样性，Y2E2处理表现最佳，Y2E1处理次之。

基于Bray–Curtis距离的主坐标分析（PCoA）显示，CK处理中土壤细菌群落聚集度低，组内变异高；而9个施肥处理聚集度较高，组内变异较低，其中Y1E2和Y3E1处理聚集度最高，组内变异最小。第一主坐标（PC1）解释18.32%的方差，第二主坐标（PC2）解释13.61%，累计解释率31.93%。组间差异显著（p=0.001），群落明显分为三组：Y3E3单独成组，其余8个施肥处理聚为一组，CK处理成另一组。

3.2.5 土壤细菌群落单因子相关网络的变化

为探究不同施肥处理下属水平细菌群落的共现特征和相互作用关系，构建了单因子相关网络。结果显示，处理间土壤细菌网络结构特征存在显著差异。细菌网络的边数在376至656之间，变化显著，而节点数处理间差异较小。细菌网络的正相关性比例处理间差异显著，Y1E2处理正相关性最高（67.11%），Y1E3次之（64.52%）。相反，CK、Y1E1、Y2E3、Y3E2和Y3E3处理的正相关性较低，均低于50.0%，分别为49.39%、48.26%、48.74%、48.14%和48.58%。单因子相关网络中的关键连接节点处理间也差异显著。9个施肥处理中，假单胞菌门、放线菌门、蓝细菌门和厚壁菌门是最重要的连接节点。对照处理（CK）中，拟杆菌门、假单胞菌门、厚壁菌门和绿弯菌门作为关键连接节点。

3.2.6 土壤细菌群落的功能预测

使用FAPROTAX工具对10个处理的细菌群落进行功能注释，识别出30个子功能。发酵、好氧化能异养和化能异养是所有处理中的主导功能。具体而言，化能异养在Y3E3（10253）、Y3E1（9266）和Y1E3（9284）中最显著；好氧化能异养在Y3E3（7571）、Y3E1（6616）和Y2E1（6501）中最高；发酵在Y1E3（2888）、Y2E3（2696）和Y3E1（2526）中最强烈。此外，与CK相比，Y1E1、Y2E2和Y3E3的锰氧化功能显著更高。类似地，与CK相比，Y1E3、Y2E3和Y3E2的叶绿体功能显著升高。

进一步分析显示，处理间特定代谢功能存在显著差异。与CK相比，Y1E2（0.03）和Y3E3（0.033）的氯酸盐还原功能显著较低。Y3E3中，铁呼吸、无氧光自养、无氧光自养S氧化和光自养功能均低于CK。与CK相比，Y1E2、Y2E1、Y2E3和Y3E3的硝酸盐呼吸和氮呼吸功能显著较低。相反，与其他施肥处理相比，CK的无氧光自养、无氧光自养S氧化和光自养丰度显著较低。

3.2.7 土壤细菌群落的聚类分析

基于距离度量对30个土壤样本进行层次聚类分析。10个处理的细菌群落分为两组：Y3E3单独成组（组1），CK处理和其他施肥处理聚在一起（组2）。进一步分析显示，在聚类阈值0.17处，组2可再分为两个亚组：CK处理形成一个 distinct亚组，其余施肥处理聚成另一亚组。此外，Y1E2、Y2E2、Y1E1、Y3E2和Y1E3处理的三个土壤样本位于同一分支，表明它们的土壤细菌群落结构高度相似。相反，CK处理和其他施肥处理分布在不同分支，反映了它们土壤细菌群落组成的差异。

3.3 植被群落特征、土壤理化性质与土壤细菌群落的耦合关系

3.3.1 植被群落特征、土壤理化性质与土壤细菌群落的Mantel检验分析

Mantel检验显示，土壤pH与电导率（SEC）呈极显著正相关（p<0.001），而两者与其他土壤理化性质和植被特征呈极显著负相关（p<0.001）。植物高度、盖度、密度和地上生物量均与土壤含水量（SWC）、有机质（SOM）、全氮（TN）和全磷（TP）呈显著正相关（p<0.001）。细菌OTU数与SOM和SWC显著相关（p<0.05），而与其他土壤理化性质和植被特征极显著相关（p<0.05）。Shannon指数与除密度和SEC外的所有土壤理化性质和植被特征显著相关（p<0.05）。Pielou指数仅与盖度和SOM显著相关（p<0.05）。Simpson指数仅与盖度显著相关（p<0.05）。Ace指数与所有四个植被特征和六个土壤理化性质显著（p<0.05）或极显著（p<0.01）相关。Chao1指数仅与pH和TN显著相关（p<0.05）。

3.3.2 植被群落特征、土壤理化性质与土壤细菌群落的冗余分析

冗余分析（RDA）探讨了土壤细菌群落多样性、植被特征和土壤理化因子之间的关系。第一轴（RDA I）和第二轴（RDA II）分别解释34.14%和10.30%的方差，累计解释率44.44%。因子中，土壤pH箭头长度最长，解释27.5%的方差，对模型贡献59.1%，效应显著（p=0.002），表明土壤pH是影响矿区细菌群落多样性的最显著因子。土壤pH和电导率（SEC）与Simpson指数正相关，但与Shannon指数、OTU数、Ace指数和Chao1指数负相关。其他土壤理化因子（如有机质（SOM）、全氮（TN）、全磷（TP））和植被特征与细菌多样性指数（除Simpson指数外）正相关。

4 讨论

4.1 EM菌肥与有机肥配施对土壤理化性质和群落特征的影响

菌肥施用将外源功能微生物群落引入土壤，从而 revitalizing土壤生态系统。当进一步配施有机肥时，可增强有机质分解过程，促进有机养分向速效形态转化，从而提高土壤养分循环效率。多项研究表明，菌肥与有机/化肥配施可显著增加退化草地恢复中的植被生物量。本研究发现，EM菌肥与有机肥配施（Y2E2处理）在连续两个生长季一致促进植被生长，生物量较对照（CK）增加75.97%和84.02%。同时，土壤含水量（SWC）、有机质（SOM）和全氮（TN）含量显著提高。但施用量存在明显阈值效应——过量施用抑制植被生长，这与以往研究结论一致。

土壤养分作为植物生长的物质基础，通过其有效可用性直接 governing植被发育。本研究数据显示，Y2E2处理通过菌肥与有机肥配施协同增强了0–10 cm表层土壤的理化性质。两年间，该处理较对照显著提高了土壤含水量（SWC）、土壤有机碳（SOC）、全氮（TN）和全磷（TP），同时显著降低了土壤电导率（SEC）和pH水平。这一改善效应源于功能菌株通过加速有机肥的矿化过程提高氮磷可用性。此外，土壤细菌代谢产生的有机酸促进有机质分解，并通过质子释放中和碱性物质，创造利于养分活化的微环境。这些发现与以往研究一致，证实菌肥与有机肥配施可增强土壤氮储量和有机质积累。值得注意的是，配施存在阈值效应：过量使用（如Y3E3处理）提高养分淋溶风险，降低养分周转效率，并引发盐碱化和pH不稳定。本研究中Y3E3的pH和SEC略高于Y2E2，表明过量养分输入下土壤缓冲能力受损。以往研究也观察到超过临界施用量会增加土壤电导率， corroborating本研究中过量施用导致的理化退化。因此，精确调控菌肥与有机肥比例对优化养分转化效率和保持土壤生态稳定至关重要。

4.2 EM菌肥与有机肥配施对土壤细菌群落结构与功能的影响

木里矿区10个处理中，假单胞菌门和放线菌门是土壤中相对丰度最高的两个优势细菌门，表明它们在该人工草地细菌群落中起关键功能作用。大量研究表明，土壤养分含量变化显著重塑细菌群落组成。Y2E3处理组中，放线菌门和酸杆菌门表现出协同富集模式，其丰度显著超过CK处理。主要原因在于土壤细菌的功能互补：放线菌门细菌通过分解木质素等复杂有机物驱动土壤碳循环，而酸杆菌门细菌稳定土壤碳库。放线菌门与酸杆菌门在土壤细菌内的这种功能互补增强了土壤碳转化效率。以往研究观察到，高磷含量和健康植被群落的生境中鞘氨醇单胞菌属（假单胞菌门的一个属）和节杆菌属（放线菌门的一个属）的相对丰度较高。这一相关性可能源于它们的双重营养特性：植物生长促进能力；优化土壤磷转化，其丰度与土壤磷水平正相关。与这些发现一致，本研究显示施肥处理中鞘氨醇单胞菌属和节杆菌属的相对丰度较CK显著升高，进一步验证了它们在磷循环和生态系统健康中的作用。

土壤细菌作为调控土壤生态系统功能的核心组分，通过其群落结构和功能特征 governing植物-土壤系统中的物质循环和能量流动。本研究发现，EM菌肥与有机肥配施显著影响土壤细菌群落多样性。Y2E2处理组中，较对照处理（CK），OTU数（操作分类单元）和Ace指数分别增加8.37%和6.44%。这些发现与以往关于菌肥与有机肥配施的结论一致。机制在于有机肥提供复杂碳源，而EM菌肥中的固氮菌和解磷菌通过分泌胞外酶加速有机质分解。这些效应创造多样化的土壤 niche，从而增强人工恢复草地土壤细菌群落的多样性。进一步单因子相关网络分析显示，Y1E2处理组的根际细菌网络复杂性较CK显著增强，正相关性比例为67.11%。这表明该处理中大多数细菌种群通过互惠共生（如养分交换）和合作共栖（如代谢互补）等策略形成紧密协作网络。如此高度连接的细菌结构优化了根际养分周转效率，加速了固氮菌和解磷菌的同步代谢活动。

以往研究表明，土壤细菌群落结构的改变导致 distinct功能特征。本研究通过基于FAPROTAX的不同施肥处理细菌功能预测 corroborates他们的发现，揭示了10个处理间显著的功能分化。值得注意的是，Y1E1和Y2E2处理的锰氧化功能强度显著高于其他组。这一增强可能源于EM肥中丰富的光合细菌，它们通过光驱动CO₂固定建立独特的光能-锰氧化耦合代谢途径。这些处理中叶绿体相关功能强度的 concurrent显著增加进一步支持了这一假设。关键的是，Y3E3处理组显示氯酸盐还原、铁呼吸和光能自养功能强度受抑制，强调过量配施可能抑制特定细菌代谢功能， reinforcing阈值效应的存在。对照处理（CK）土壤细菌的光合自养相关功能强度显著低于其他施肥处理。潜在原因可能归因于木里矿区原位土壤有机质输入长期缺乏，导致光合细菌生长所需底物（如硫化物、低分子量有机化合物）严重短缺，从而约束了其代谢活性。

4.3 根际土壤微生物组成与土壤理化性质及植物群落特征的相关分析

Mantel检验分析显示，土壤pH与电导率（SEC）呈极显著正相关（p<0.001），而两者与其他土壤理化性质和植被群落特征呈极显著负相关（p<0.001）。这些发现与以往研究一致，认为较高土壤养分和水分水平促进更优植物群落生长。冗余分析（RDA）进一步证明，土壤SEC与细菌群落多样性指数（Shannon、Ace和Chao1）负相关，表明土壤盐胁迫显著抑制细菌多样性恢复。相反，植被群落性状和土壤肥力指标有机质（SOM）、全氮（TN）和全磷