超灵敏f-ELISA传感器的开发用于现场比色检测芬太尼和去甲芬太尼

本研究开发了一种基于三聚氰胺泡沫（MF）的酶联免疫吸附测定（f-ELISA）传感器，实现了对芬太尼及其代谢物去甲芬太尼的超高灵敏度（最低检测限达0.001 mg L?1）、高选择性现场比色检测。该传感器无需依赖实验室仪器，通过智能手机辅助分析，在环境水样和人工尿液中表现出卓越性能，为法医鉴定和环境监测提供了革命性的便携式检测工具。

　　

1 引言

芬太尼作为一种强效合成阿片类药物，虽具医疗价值但被美国缉毒局（DEA）列为二级管制物质。近年来非法制造的芬太尼已成为公共健康威胁，常与其他毒品混合导致过量中毒事件激增。2021年至2022年间，美国芬太尼相关过量死亡人数从57834人增至71238人，仅2毫克即可致命。

人体摄入芬太尼后，经肝脏CYP3A4酶代谢产生去甲芬太尼——一种可在体液中存留长达26天的非活性代谢物。实验室通常采用高效液相色谱（HPLC）、液相色谱质谱联用（LC-MS）等技术检测，但这些方法存在耗时长、仪器昂贵、需专业操作等局限。

传统酶联免疫吸附测定（ELISA）虽具高灵敏度，但成本高且依赖微孔板读数仪。纸基ELISA（p-ELISA）虽成本低，但其异质纤维结构会抑制大分子抗体和酶的扩散效率。最新研究采用具有60-150微米互联大孔结构的三聚氰胺泡沫（MF）开发f-ELISA平台，实现了生物分子的快速扩散和均匀渗透，克服了纸基系统的局限性。

2 结果与讨论

2.1 制备与表征

研究通过N,N'-二琥珀酰亚胺碳酸酯（DSC）和氰尿酰氯（CC）对MF进行化学修饰，分别引入N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和氯三嗪基团。衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）显示1707 cm^?1处出现氨基甲酸酯峰，794 cm^?1处出现碳-氯峰，证实修饰成功。扫描电子显微镜（SEM）显示修饰后MF形态未变，但CC修饰的MF因非极性基团呈现更高疏水性。

2.2 芬太尼生物传感器优化

采用竞争性检测方案，优化抗体稀释比例确定为1:2000。对比NHS@MF和CC@MF，后者显示出更优灵敏度、更小误差条和更均匀的颜色分布。确定最佳孵育时间为2分钟，此时0.001 mg L^?1芬太尼即可产生肉眼可见的颜色差异（ΔR^?1值从4.67×10^?3增至6.68×10^?3）。

2.3 芬太尼生物传感器性能

传感器在0-0.020 mg L^?1范围内呈现良好线性关系（y = 3.19x + 0.0041, R²=0.99）。肉眼可区分0.005 mg L^?1，智能手机辅助可检测0.001 mg L^?1。选择性测试表明，氯霉素（CAP）、四环素（TC）、毒死蜱（CPS）及去甲芬太尼均无交叉反应，ΔR^?1值差异达10倍。

2.4 样品体积对f-ELISA的影响

MF的大孔结构允许大体积样品自由流动。当样品体积从100 μL增至2 mL时，最低检测浓度可达0.0005 mg L^?1，这种体积响应型信号增强体现了该平台在环境样品检测中的独特优势。

2.5 在水和尿液检测中的应用

在校园 arboretum 废水测试中，传感器显示0.001 mg L^?1的肉眼可辨差异（R²=0.97）。人工尿液中因叠氮化钠对辣根过氧化物酶（HRP）的抑制效应，检测限降至0.005 mg L^?1（R²=0.78）。表明该传感器更适用于环境水样的精确量化，而对尿液样品主要适用于定性筛查。

2.6 生物传感器储存稳定性

4°C储存35天后仍保持60%生物活性，室温7天后活性损失约40%。MF支撑的抗体分子可能限制了构象变化，减少了变性可能性。

2.7 去甲芬太尼生物传感器优化

确定最佳抗体浓度为10 mg L^?1，HRP稀释比例为1:1000，最佳孵育时间6分钟。在0-0.010 mg L^?1范围内呈现良好线性（y = 1.91x + 0.0046, R²=0.99），检测限达0.001 mg L^?1。

2.8 去甲芬太尼生物传感器性能

灵敏度与芬太尼传感器相当，但0.020 mg L^?1超出定量范围，可能与抗原-抗体结合动力学差异有关。

3 结论

f-ELISA传感器成功实现了对芬太尼和去甲芬太尼的快速、超灵敏、选择性现场检测。CC修饰的MF表现出更好的颜色响应性。芬太尼传感器在环境水样中表现优异，而去甲芬太尼传感器为确认药物滥用提供了重要补充。该技术为法医、环境和公共卫生应用提供了低成本、便携的检测工具。

4 实验部分

研究使用DSC和CC对MF进行化学修饰，通过SEM和FTIR进行表征。采用竞争性ELISA流程，以100 μL 1:2000稀释抗体进行 immobilization。TMB底物孵育后，通过智能手机采集图像，Photoshop软件分析红色通道值（ΔR^?1）。所有实验均进行三次重复实验，数据以均值±标准差表示。