抗氧化硒代蛋氨酸碳点缓解椎间盘退变中的氧化应激：机制与治疗前景

本文推荐一种新型硒掺杂碳点（Se-Met-CD），其通过高效清除活性氧（ROS）、恢复细胞氧化还原稳态、调控细胞外基质（ECM）代谢并抑制炎症与凋亡，显著延缓了大鼠椎间盘退变（IVDD）进程，为退行性脊柱疾病的纳米干预策略提供了新思路。

　　

1 引言

椎间盘退变（IVDD）是一种以脊柱退行性改变为特征的常见临床疾病，是椎间盘突出、退行性腰椎滑脱和椎管狭窄等疾病的病理基础。它是导致腰痛的主要原因，在晚期病例中会导致进行性运动障碍和严重残疾。IVDD的发病机制涉及髓核细胞（NPCs）存活和功能丧失引发的多方面级联反应。这种细胞功能障碍导致了一个恶劣的微环境，其特征是氧化应激升高、慢性炎症和细胞外基质（ECM）代谢紊乱，最终导致椎间盘进行性结构损伤。全球约有6.23亿人受腰痛影响，其中约40%的病例以IVDD为主要原因。目前的临床管理包括手术 procedures，如全椎间盘置换、椎间融合和部分椎间盘切除术，以及药物治疗，包括非甾体抗炎药、镇痛药和肌肉松弛剂。然而，这些干预措施主要缓解症状，并不能阻止疾病进展。因此，迫切需要能够中断IVDD退行循环并恢复椎间盘内稳态的治疗策略。

许多治疗策略已在基础研究环境中被探索用于减缓IVDD的进展，包括减轻氧化应激、抑制分解代谢活性、抑制炎症、刺激合成代谢过程、预防细胞衰老、抑制凋亡以及开发精细的生物疗法。其中，基于抗氧化的疗法因其减轻氧化应激的能力而显示出相当大的前景。然而，传统的抗氧化剂由于清除ROS的能力不足，往往表现出有限的疗效。在此背景下，具有内在抗氧化特性的先进纳米材料提供了一个引人注目的替代方案。

本研究设计并利用了基于碳点（CD）的抗氧化剂，以研究硒（Se）与硫（S）相比的关键影响。使用硒代蛋氨酸（Se-Met）和蛋氨酸（Met）作为单一前体，本研究发现Se掺杂显著增强了CDs的抗氧化性能。所得的Se-Met-CD在体外保护NPCs免受氧化损伤，保持ECM稳态，并在大鼠模型中显著减轻IVDD进展。这些发现突出了Se-Met-CD作为一种治疗性纳米材料的潜力，能够同时中和IVDD中的氧化应激并恢复椎间盘稳态。

2 结果与讨论

2.1 Se-Met-CD的合成与表征

CDs是新兴的零维碳纳米材料，由于其优异的生物相容性、易于合成和可调的光学特性，在生物医学中具有强大潜力。重要的是，它们的内在生物活性可以通过前体选择和杂原子掺杂进行精确定制。

本研究的一个关键目标是系统研究和分离Se掺杂对CDs治疗性能的具体贡献。为实现此目标，使用缬氨酸（Val）、Met和Se-Met作为前体合成并比较了三种不同类型的CDs。选择Val和Met作为对照是因其与Se-Met具有显著的结构相似性。具体来说，所有三种氨基酸前体都具有可比数量的碳原子，确保了所得CDs的碳骨架一致。此外，它们都是具有非极性、疏水侧链的中性氨基酸，缺乏额外的带电官能团。这种精心设计的比较框架至关重要，因为它最大限度地减少了可能由结构不同的前体引起的CDs基本物理化学性质的潜在变化。因此，可以确信地将其对抗IVDD的优异抗氧化性能和增强的治疗效果主要归因于掺杂硒的特定作用，而不是其他混杂的结构因素。

在本工作中，Se-Met-CD、Met-CD和Val-CD是使用简单的一步热法从各自的前体氨基酸合成的。通过迭代实验确定最佳合成温度分别为Se-Met 160 °C、Met 180 °C和Val 220 °C，对应于每种CD的最高产率。在此条件下，Se-Met-CD、Met-CD和Val-CD的荧光量子产率分别为5.4%、7.1%和12.1%。由于键解离通常是CDs形成过程中热解和碳化的限速步骤，最佳温度的差异可能反映了键解离能和侧链反应性的差异。Val含有比Met中的C─S键具有更高解离能的稳定C─C和C─H键，而C─S键又比Se-Met中的C─Se键更稳定。与Val相比，Se和S更大的反应性使得Met和Se-Met的降解和聚合在更低的温度下发生。这些发现与水热条件下含Se和S化合物的报告热稳定性趋势一致。

使用透射电子显微镜（TEM）检查合成CDs的形态和尺寸。平均粒径为Val-CD 2.44 nm，Met-CD 2.94 nm，Se-Met-CD 3.08 nm。相似的尺寸可能源于一致的合成方法和前体氨基酸的结构相似性。

为了研究合成过程中的结构转变，使用傅里叶变换红外（FT-IR）光谱分析了CDs及其前体的化学结构。FT-IR光谱在3425 cm^?1处表现出吸收峰，这归因于N─H和O─H键的伸缩振动。2968和2880 cm^?1处的峰对应于C─H键的伸缩振动，1587 cm^?1处的峰归属于羧基C═O键的伸缩振动。1510和1395 cm^?1处的峰分别归因于N─H和C─H键的弯曲振动。CDs及其相应的前体在基本相同的位置显示出红外吸收峰，但热解产物表现出更弱的强度，表明前体氨基酸的一些键已被断裂，官能团数量减少。这些变化证实了氨基酸向碳基纳米结构的转化。

为了确认石墨碳骨架的形成（CDs的一个特征），进行了X射线衍射（XRD）分析。所有三种类型的CDs在20°至30°（2θ）之间都表现出一个宽而弱的衍射峰，对应于石墨碳的（002）晶面。这表明CDs的成功合成。Val-CD的峰出现在24.7°，而Met-CD和Se-Met-CD的峰分别出现在19.3°和19.6°。Met-CD和Se-Met-CD峰的接近可能归因于其前体氨基酸的高度结构相似性，它们仅相差一个原子。

使用X射线光电子能谱（XPS）进一步研究了CDs的表面元素组成和化学键合状态。扫描确认每种CD类型的化学组成紧密反映了其各自前体氨基酸的结构，高分辨率光谱识别了关键元素的具体化学状态。

对于Val-CD，未检测到S或Se信号，确认了无异原子污染。高分辨率C 1s光谱被解卷积为四个峰，对应于284.8 eV（C─C/C═C）、286.2 eV（C─H）、286.9 eV（C─O）和288.3 eV（C═O）。O 1s光谱显示峰在531.4 eV（C═O）、532.7 eV（C─O）和534.2 eV（吸附氧）。相对较高比例的C─O表明在碳化过程中通过缩合形成了C─O─C桥键。N 1s光谱分析揭示了多种氮构型，包括吡啶氮、吡咯氮和石墨氮，表明氮原子以吡咯型构型嵌入碳骨架中。

对于Met-CD，S 2p光谱在163.6和164.8 eV处显示出峰，归因于典型硫醚结构的S 2p_3/2和S 2p_1/2组分。C 1s光谱呈现峰在284.8 eV（C─C/C═C）、286.5 eV（C─N/C─O）和288.2 eV（C═O），与Se-Met-CD观察到的一致。这证实了来自蛋氨酸前体的硫共价整合到碳骨架中而未发生氧化。

对于Se-Met-CD，高分辨率Se 3d光谱在54.2 eV处显示一个双峰，是Se─C键的特征。在58–60 eV范围内未检测到信号，排除了氧化硒物种的存在，并确认了Se以有机结合状态的稳定掺入。C 1s光谱的解卷积揭示了284.8 eV（C─C/C═C）、286.1 eV（C─N/C─O/C─Se）和288.3 eV（C═O）处的峰，表明存在部分石墨化的碳核，保留了氨基和羧基官能团。N 1s光谱在399.8和401.1 eV处呈现双峰，分别对应于中性胺（?NH₂）和质子化胺（?NH₃⁺）官能团。总的来说，这些XPS结果表明它们的氨基酸前体直接支配CDs的化学结构。

随后使用紫外-可见（UV-vis）吸收光谱和光致发光（PL）测量来表征CDs的光学特性，这对它们的生物医学应用至关重要。Val-CD和Met-CD的UV-vis光谱中未观察到明显的吸收峰。相反，Se-Met-CD水溶液的UV-vis光谱在320 nm处显示出一个明显的吸收峰，这可归因于涉及表面或分子状态的n→π*（羧基和/或C─N/C─Se）跃迁。与先前报道的源自硒代胱氨酸的CDs（在≈340 nm处表现出类似的吸收最大值）相比，该峰略有蓝移。这种峰位置的差异可归因于两种前体固有的结构差异以及合成条件的变化。

还检查了激发依赖性光致发光，这是CDs的一个标志性特性。与其他CDs类似，所有三种类型的CDs都表现出典型的激发依赖性光致发光，荧光发射光谱随不同激发波长而发生位移。例如，将Val-CD的激发波长从300 nm改变到460 nm导致发射从415 nm红移到525 nm。这是在CDs中观察到的常见光学现象，进一步证实了所有三种类型CDs的成功合成。Val-CD在360 nm激发下观察到最大PL强度，而Met-CD和Se-Met-CD均在390 nm处表现出最大PL强度。为了精确表征它们的光学参数，获得了每种CD的激发和发射光谱。Val-CD在360 nm处显示出一个明显的激发峰，并在436 nm处有相应的发射峰。相比之下，Met-CD和Se-Met-CD均在390 nm处表现出最佳激发，发射最大值集中在470 nm。Met-CD和Se-Met-CD光学行为的密切相似性可能源于其前体氨基酸的结构相似性。

鉴于开发减轻氧化应激的治疗策略的核心目标，进行了一系列测定来比较Se-Met-CD、Met-CD和Val-CD的ROS清除性能。

初步评估涉及在加入过氧化氢（H₂O₂）后监测CDs荧光光谱的变化，随后量化了峰处的归一化荧光强度。Val-CD和Met-CD在加入H₂O₂后表现出逐渐的荧光猝灭，这可能是因为表面基团（如羟基和氨基）的氧化改变了化学结构并破坏了发射状态。相反，Se-Met-CD在加入H_{O2后表现出逐渐的荧光增强。这种增加源于表面结合的Se原子的氧化。最初，Se以还原态存在，充当非辐射陷阱从而猝灭荧光。这些基团氧化成更高价态可能钝化了表面缺陷并减少了非辐射复合，从而提高了量子产率。这些结果与先前关于其他含Se CDs暴露于H2O2的报告一致，并突出了Se-Met-CD在氧化条件下的特异性。}

为了量化抗氧化潜力，使用成熟的2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）测定法测量了CDs及其相应前体氨基酸的总抗氧化能力。所有三种CDs都表现出比其前体氨基酸显著更高的抗氧化能力。值得注意的是，Se-Met-CD的抗氧化能力是其Se-Met前体的3.1倍。此外，其效力分别是Met-CD和Val-CD的约3.9倍和5.6倍。在前体中，只有Se-Met具有可检测的活性，而Met和Val显示出可忽略的效果。

为了验证这些发现，还评估了CDs及其前体的2,2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）自由基清除能力。再次，Se-Met-CD显示出最强的DPPH清除能力，其次是Met-CD和Val-CD。然而，三种CDs之间的差异不如ABTS测定中那么明显，这可能归因于不同的潜在反应机制。

总之，Se-Met-CD表现出最有效的抗氧化能力，Met-CD显示出中等能力，Val-CD的抗氧化活性最弱。关键的是，所有三种CDs的性能都优于其各自的前体氨基酸。Se-Met-CD在存在H₂O₂的情况下增强的荧光响应，及其在ABTS和DPPH测定中的良好表现，突显了Se的氧化还原化学是其高效ROS清除活性的关键。这些发现强调Se掺杂的CD比未掺杂的对应物更有效地充当抗氧化剂。

Se-Met-CD优异的抗氧化性能可归因于掺入硒原子的内在氧化还原特性。在合成过程中，来自Se-Met前体的硒被掺杂到碳骨架中，产生高反应位点。这些位点可能以还原形式存在，例如CD表面的硒醚部分（─Se─CH₃）。硒部分通过氧化还原反应直接有效地中和ROS，如H₂O₂，其中硒本身被氧化。这一提议的机制得到了加入H₂O₂后观察到的荧光增强的有力支持。还原的硒物种充当非辐射陷阱从而猝灭荧光，它们氧化成如硒氧化物等物种使这些陷阱钝化，导致荧光强度增加。相比之下，Met-CD中的硫原子在此作用中效果较差。由于C─Se的键能低于C─S，且硒醇的亲核性高于硫醇，Se-Met-CD中的硒活性位点具有更有利的氧化还原电位用于ROS清除。这种内在的化学优势解释了为什么Se掺杂赋予CD比S掺杂 substantially更大的抗氧化能力，为开发基于硒的材料治疗氧化应激相关疾病（如IVDD）提供了明确的理由。

2.2 Se-Met-CD通过抑制氧化应激对髓核细胞的保护功效和机制

在评估治疗潜力之前，使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）测定法评估了合成CDs与NPCs的生物相容性。在与浓度范围为0.0至100.0 μg mL^?1的CDs孵育24小时后，未观察到细胞活力的显著降低，存活率与对照组相比在统计学上具有可比性。该结果证实了三种类型CDs的生物安全性。

为了建立氧化应激模型，随后用不同浓度的H₂O₂处理NPCs 24小时。选择200.0 μM H₂O₂用于后续实验，因为它将细胞活力降低至≈50%。然后将NPCs与200.0 μM H₂O₂和不同浓度的每种CD共同孵育24小时，并测量细胞活力。Se-Met-CD表现出最显著的保护作用，10.0 μg mL^?1将细胞活力恢复到对照水平的88.6%。更高浓度没有产生额外益处。对于Met-CD，在60.0 μg mL^?1浓度下细胞活力达到≈86.3%。100.0 μg mL^?1的Val-CD仅产生轻微的活力改善，并且显著不如Se-Met-CD和Met-CD有效。

细胞也与H₂O₂和前体氨基酸共同孵育。80.0 μg mL^?1的Se-Met将活力恢复到对照组的88.9%，更高浓度没有提供进一步改善。Met仅在400.0 μg mL^?1的高浓度下表现出抗氧化活性，而Val未显示保护作用。因此，所有三种类型的CDs都表现出比其各自前体氨基酸改善的抗氧化性能。基于这些发现，选择10.0 μg mL^?1的Se-Met-CD和60.0 μg mL^?1的Met-CD作为最佳保护浓度。100.0 μg mL^?1浓度的Val-CD在后续实验中用作参考组。

为了评估细胞摄取并探究效用，研究了CDs的细胞内定位和荧光行为。将NPCs与100.0 μg mL^?1的每种CD共培养，显微镜检查通过强而稳定的细胞内荧光信号确认了成功摄取。使用ImageJ对共聚焦图像中的积分荧光强度进行量化。结果表明，所有三种类型的CDs在3小时内都被细胞有效内化，细胞内荧光强度在9小时达到峰值。CDs主要定位于细胞质，与先前的发现一致。12小时后，荧光强度略有下降。观察到Se-Met-CD的荧光较弱，这归因于其较低的量子产率。Met-CD的平均荧光强度与Val-CD相似，可能是因为用于激发的488 nm激光线更接近Met-CD的最佳激发范围。我们的发现清楚地证明了合成的CDs在NPCs中的有效内化。虽然控制这种摄取的精确分子机制尚未通过实验确定，但理解该途径对于解释观察到的生物活性至关重要。文献描述了此尺寸纳米粒子的几种潜在内吞途径，包括网格蛋白介导的内吞作用、小窝介导的内吞作用和巨胞饮作用。未来的机制研究 employing specific endocytic inhibitors will be necessary to definitively elucidate this crucial mechanism.

为了直观地确认CDs对氧化应激诱导的细胞死亡的保护作用，进行了钙黄绿素-AM/碘化丙啶（PI）活/死染色。用含有Se-Met-CD (10.0 μg mL^?1)、Met-CD (60.0 μg mL^?1) 或 Val-CD (100.0 μg mL^?1) 的DMEM/F12处理NPCs，并共同暴露于终浓度为300.0 μM的H₂O₂。孵育8小时后，移除处理培养基，并对细胞死亡率进行量化。10.0 μg mL^?1浓度的Se-Met-CD处理显示出最有效的保护作用，将细胞死亡率显著降低至仅5.6%，而H₂O₂处理的对照组为18.8%。60.0 μg mL^?1的Met-CD也提供了显著的保护，导致死亡率为8.3%。相比之下，Val-CD的效果不太明显，死亡率为15.1%。与CCK-8活力结果相印证，这些发现强调了Se-Met-CD against oxidative stress的 robust cytoprotective role。

为了确定观察到的细胞保护作用是否归因于ROS的清除，测量了NPCs中的细胞内ROS水平。为了分析细胞内ROS水平，将NPCs与H₂O₂和 respective compounds共同孵育，随后使用细胞内ROS检测探针和共聚焦显微镜进行可视化。图像是明场和荧光通道的叠加，其中绿色荧光指示细胞内ROS水平。如图所示，在用H₂O₂刺激后ROS水平显著增加。用100.0 μg mL^?1 Val-CD、60.0 μg mL^?1 Met-CD和10.0 μg mL^?1 Se-Met-CD处理将ROS水平分别降低至H₂O₂单独组的33.8%、25.1%和17.7%。相比之下，用三种前体氨基酸处理并未导致ROS水平的任何显著降低。这些发现证实了氨基酸衍生的CDs，特别是Se-Met-CD，在氧化应激条件下有效清除细胞内ROS。

已知过度的氧化应激会导致NPCs凋亡。因此，凋亡率被用作氧化损伤的关键指标。使用Annexin V-异硫氰酸荧光素（FITC）/PI双染色和流式细胞术评估凋亡。结果绘制在图中，其中x轴代表FITC的荧光强度，y轴代表PI的荧光强度。这些图中的Q4象限对应于早期凋亡细胞，而Q1象限代表晚期凋亡或坏死细胞。与H₂O₂处理的对照组相比，所有三种CDs都显著减少了早期和晚期凋亡。

计算凋亡细胞的总百分比以量化CDs的保护作用。用10.0 μg mL^?1的Se-Met-CD处理提供了最显著的保护，将总凋亡率从H₂O₂处理的对照组的32.9%降低到仅6.1%。用60.0 μg mL^?1的Met-CD处理也有效减轻了凋亡，导致率为10.0%，而100.0 μg mL^?1的Val-CD显示出不太明显的效果，率为13.0%。相比之下，前体氨基酸的抗凋亡作用 substantially weaker than those observed for their corresponding CDs。

总之，Se-Met-CD和Met-CD通过清除细胞内ROS并在体外氧化应激条件下抑制早期和晚期凋亡，有效保护NPCs免受氧化应激诱导的损伤。这些CDs表现出比其前体氨基酸更强的抗氧化能力。

为了阐明CDs抗凋亡和抗氧化作用的分子机制，使用定量PCR和Western blotting分别分析了基因和蛋白质表达的变化。

在转录水平上，检查了聚集蛋白聚糖（Acan）和II型胶原（Col-II）的表达，这是涉及软骨基质合成的两个关键基因。Acan是ECMs的核心组成部分和基质合成代谢的标志物，而Col-II形成纤维网络，维持椎间盘结构和机械功能。在H₂O₂处理的对照组中，Acan和Col-II的表达均被显著抑制至正常组的35.3%和43.3%，表明ECM合成受损。虽然Val-CD和Met-CD适度缓解了这种抑制，但Se-Met-CD substantially more effective，将Acan和Col-II的表达恢复到正常组的78.3%和87.3%，接近未处理正常组的水平。

通过分析基质降解酶的表达来评估CDs对基质分解代谢的影响。含血小板反应蛋白基序的解整合素金属蛋白酶5（ADAMTS-5）是降解Acan的主要酶，而基质金属蛋白酶13（MMP-13）降解ECM成分，如Col-II和IX型胶原。两种酶的上调都与IVDD中的ECM降解密切相关。在对照组中，MMP-13和ADAMTS-5的表达水平分别是正常组的5.6和6.4倍。用Val-CD处理将这些水平降低到正常组的3.0和3.3倍。Met-CD进一步将表达抑制到正常组的1.7和1.9倍，而Se-Met-CD最有效，将表达降低到仅正常组的1.2和1.2倍。关键的是，Se-Met-CD的这种有效抑制导致MMP-13和ADAMTS-5的表达分别降低到H2O2处理的对照组观察到的水平的20.9%和19.1%。

接下来，研究了参与抗氧化防御和凋亡的基因的表达。核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）是一个关键的转录因子，调节抗氧化基因的表达，包括血红素加氧酶-1和NAD(P)H醌氧化还原酶1，并在维持氧化还原稳态中起核心作用。Se-Met-CD显著上调了NPCs中Nrf2的表达，将其恢复到正常水平的97.0%，与H₂O₂处理的对照组观察到的37.0%相比有 substantial increase。这种上调激活了细胞抗氧化防御系统，从而减轻了氧化应激的损伤。Caspase-3是一个关键的效应蛋白酶，在凋亡过程中起核心作用。在遭受氧化应激的对照NPCs中，caspase-3的表达水平上调了6.2倍，导致凋亡显著增加。Se-Met-CD将caspase-3表达降低至对照水平的18.7%，证实了其减轻氧化应激诱导的凋亡的能力。

为了完成遗传分析，评估了促炎细胞因子的表达。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是一种 central pro-inflammatory mediator，可放大炎症并导致细胞损伤和凋亡。白细胞介素-1β（IL-1β）促进ECMs降解酶（如MMP-13）的表达，并在IVDD和骨关节炎等疾病中起关键作用。氧化应激后，TNF-α和IL-1β水平均上调至5.5倍。在Se-Met-CD和Met-CD组中，两种细胞因子的表达均显著下调，其中Se-Met-CD组表现出最有效的作用，将TNF-α和IL-1β表达水平分别抑制至其各自对照水平的20.8%和22.1%。

为了在蛋白质水平验证基因表达结果，进行了Western blotting。氧化应激显著降低了NPCs中Acan和Col-II的蛋白质水平，分别仅为正常水平的15.6%和18.9%。然而，在Se-Met-CD组中，两种蛋白质的表达均得到 substantially restored，Acan达到正常水平的68.4%，Col-II达到106.2%。与正常组相比，对照NPCs中的MMP-13蛋白质水平增加了6.8倍，表明基质降解加速。Se-Met-CD显著抑制了这种上调，将MMP-13表达降低至正常组的1.91倍，从而证明了其帮助保持ECM完整性的能力。TNF-α蛋白质水平在Val-CD组中保持高位，并且仅被Met-CD略微降低。相比之下，Se-Met-CD显著下调TNF-α表达至对照水平的62.6%，表明具有强大的抗炎作用。此外，氧化应激诱导细胞衰老标志物细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1（p21）的表达上调4.7倍。Se-Met-CD有效 counteracted this effect，将p21表达抑制至仅正常组的2.0倍。该结果表明Se-Met-CD抑制氧化应激诱导的细胞衰老。

总的来说，这些结果表明Se-Met-CD against oxidative stress的 superior protective efficacy源于其 potent intrinsic antioxidant properties，使其能够有效清除细胞内ROS，从而有效减轻氧化应激。这种关键的上游干预有效破坏了由氧化应激引发的下游损伤级联。它通过双重调节机制恢复ECM稳态，同时上调关键的合成代谢基因Acan和Col-II，并有效抑制核心基质降解酶MMP-13和ADAMTS-5。Se-Met-CD还激活了内源性Nrf2抗氧化途径，从而增强了内在的细胞防御能力。此外，它抑制促炎细胞因子TNF-α和IL-1β的表达，并下调凋亡的关键介质，如caspase-3和衰老标志物p21，从而保护NPCs的活力和功能。关键的是，所有这些多方面的保护作用对于Se-Met-CD都比其对应物Met-CD和Val-CD substantially more pronounced。

总之，这些发现系统地揭示了Se-Met-CD通过减轻氧化应激来调节ECM代谢、炎症、凋亡和衰老的多方面机制。这一全面的证据支持将Se-Met-CD作为一种有前途的纳米干预策略应用于IVDD。

2.3 Se-Met-CD在体内减轻椎间盘退变的功效

在体外确立了Se-Met-CD和Met-CD against oxidative stress的保护作用后，接下来在IVDD大鼠模型中验证了它们的治疗效果。根据其体外最佳性能，选择10.0 μg mL^?1的Se-Met-CD和60.0 μg mL^?1的Met-CD进行动物实验。使用