肝脏胞质氧化还原状态依赖的糖异生调控不同强度运动能力的机制研究

本研究揭示了肝脏通过调控胞质NADH/NAD+比率，选择性利用乳酸和甘油进行糖异生，从而分别影响高强度与低强度运动能力的新机制。研究人员通过构建肝脏特异性PCK1和GYK敲除模型，结合LbNOX介导的NADH氧化技术，发现两条糖异生通路的相互补偿作用受胞质氧化还原状态调控。该研究为运动代谢调控提供了新靶点，对运动生理学和代谢疾病治疗具有重要启示。

　　

在日常生活中，肝脏持续产生葡萄糖以满足机体不断变化的能量需求。运动作为最大的代谢挑战之一，需要肝脏高度上调糖异生过程，这一过程依赖于乳酸和甘油等糖异生底物的供应增加。肌肉糖酵解产生的乳酸在高强度运动中显著增加，而脂肪分解产生的甘油则在低强度运动中更为重要。然而，在不同强度运动条件下，这些底物如何被优先利用以及其背后的调控机制尚不清楚。

为了阐明不同强度运动过程中肝脏利用各糖异生底物的生理重要性，Takahiro Horiuchi等研究人员在《Nature Metabolism》上发表了他们的最新研究成果。他们发现乳酸和甘油的优先供应调节着肝脏糖异生，从而分别影响高强度和高强度运动能力。

研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：使用他莫昔芬诱导的肝脏特异性基因敲除技术构建L-Pck1KO和L-GykKO小鼠模型；通过腺病毒载体介导的LbNOX表达系统调控肝脏胞质NADH/NAD⁺比率；采用稳定同位素标记的代谢流分析技术测定运动过程中的葡萄糖生成速率；运用运动耐力测试平台评估不同基因型小鼠的运动能力；通过高效液相色谱-高分辨率质谱联用技术精确测量代谢物浓度和同位素富集度。

Fig.1|L-Pck1KO和L-GykKO分别降低高强度和低强度运动能力

研究人员首先构建了肝脏特异性磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1(PCK1)和甘油激酶(GYK)敲除小鼠模型。PCK1是乳酸糖异生途径的关键酶，而GYK是甘油糖异生途径的关键酶。通过他莫昔芬诱导后，敲除小鼠肝脏中相应的靶基因和蛋白几乎检测不到，而其他器官和组织中的表达变化极小。在静息状态下，两种敲除小鼠的体成分、血糖和肝糖原含量与对照组相似，表明在静止条件下这些敲除不足以改变血糖水平。

然而，在运动实验中，L-Pck1KO小鼠的高强度运动能力降低，而L-GykKO小鼠的低强度运动能力降低。具体来说，L-Pck1KO小鼠在高强度运动后血糖降低，血浆乳酸水平升高；而L-GykKO小鼠在低强度运动后血糖降低，血浆甘油水平升高。这些结果表明，肝脏通过PCK1介导的乳酸糖异生和GYK介导的甘油糖异生分别在高强度和低强度运动中作为主要能量来源。

Fig.2|L-Pck1KO和L-GykKO分别通过增强甘油和乳酸糖异生提高低强度和高强度运动能力

令人惊讶的是，L-Pck1KO显著提高了低强度运动能力，平均延长约100分钟。在60分钟低强度运动后，L-Pck1KO小鼠血糖水平升高，血浆甘油上升幅度较小。相反，L-GykKO提高了高强度运动能力，在20分钟高强度运动后，L-GykKO小鼠血糖水平升高，血浆乳酸升高较温和。

通过同位素代谢流分析，研究人员发现，在静止状态下，L-Pck1KO或L-GykKO小鼠的葡萄糖出现率与对照组无显著差异。然而，在运动过程中，虽然两种强度的运动都增加了对照组小鼠的葡萄糖出现率，但敲除小鼠的上升幅度更大。特别是，¹³C标记的葡萄糖在L-Pck1KO小鼠低强度运动期间和L-GykKO小鼠高强度运动期间分别比对照组更高。这些结果强有力地证实了L-Pck1KO和L-GykKO分别通过增强低强度运动中的甘油糖异生和高强度运动中的乳酸糖异生来提高运动能力的假设。

Fig.3|肝脏胞质氧化还原状态介导L-Pck1KO小鼠中甘油糖异生和L-GykKO小鼠中乳酸糖异生的增强

接下来，研究人员探索了每种敲除小鼠中糖异生 reciprocal 增强的机制。通过一系列糖异生底物耐受试验，他们发现L-Pck1KO小鼠在给予甘油后血糖水平比对照组更高，而在给予二羟基丙酮(DHA)后无此现象，表明从甘油到二羟基丙酮磷酸的步骤在L-Pck1KO小鼠中增强。相反，L-GykKO小鼠在给予乳酸后血糖升高比对照组更明显，而在给予丙酮酸或丙氨酸后无此现象，表明从乳酸到丙酮酸的转化步骤在L-GykKO小鼠中增强。

有趣的是，这两个增强的步骤都是氧化还原依赖性的，即依赖于胞质烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化形式(NAD⁺)向其还原形式(NADH)的转化。因此，研究人员推测L-Pck1KO和L-GykKO改变了肝脏胞质氧化还原状态，从而分别增强了甘油和乳酸的糖异生。

通过测量肝脏[乳酸]/[丙酮酸]比率（胞质[NADH]/[NAD⁺]比率的可靠指标），他们发现L-Pck1KO和L-GykKO小鼠的肝脏[乳酸]/[丙酮酸]比率显著降低。此外，在离体实验中，使用分离的原代肝细胞，PCK1缺失肝细胞中从甘油增加的葡萄糖产生以及GYK缺失肝细胞中从乳酸增加的葡萄糖产生都被乙醇处理所消除，乙醇 reportedly 将NAD⁺转化为NADH。这些发现清楚地表明，通过替代未阻断的糖异生途径增加氧化还原依赖性底物的糖异生主要是由一条途径的阻断导致肝脏胞质[NADH]/[NAD⁺]比率降低所引起的。

Fig.4|肝脏LbNOX表达通过增强氧化还原依赖性糖异生提高两种强度运动的运动能力

为了进一步研究改变的肝脏胞质氧化还原状态是否足以增强运动能力，研究人员应用了来自短乳杆菌的水形成NADH氧化酶(LbNOX)，该酶将胞质NADH转化为NAD⁺而不影响线粒体氧化还原状态。使用腺病毒系统，他们在C57BL/6J小鼠肝脏中选择性诱导了LbNOX(Ad-LbNOX小鼠)，这降低了肝脏[乳酸]/[丙酮酸]比率，而全肝[NADH]/[NAD⁺]比率没有显著变化。

正如预期，Ad-LbNOX小鼠在给予氧化还原依赖性底物（乳酸和甘油）后血糖水平高于对照组，而在给予氧化还原非依赖性底物（丙酮酸、丙氨酸和DHA）后则无此现象。值得注意的是，肝脏LbNOX表达显著提高了两种强度运动的运动能力。在C57BL/6N小鼠中肝脏LbNOX表达也产生了类似的结果。一致地，与对照组相比，Ad-LbNOX小鼠在高强度运动中表现出更高的血糖、更低的血浆乳酸和相似的血浆甘油水平，或在低强度运动中表现出更低的血浆甘油和未改变的血浆乳酸水平。因此，降低的肝脏胞质[NADH]/[NAD⁺]比率足以增强两种强度运动的运动能力。

最重要的是，LbNOX诱导的高强度和低强度运动能力的增强几乎完全被L-Pck1KO和L-GykKO分别阻断。这些结果清楚地表明，响应肝脏胞质[NADH]/[NAD⁺]比率降低而增强的运动能力基本上归因于高强度运动中乳酸糖异生和低强度运动中甘油糖异生的增强。在雌性小鼠中也获得了类似的结果。此外，尽管大多数实验在禁食动物上进行以专注于糖异生，但即使在自由饮食条件下也获得了类似的结果，可能因为肝糖原在力竭前已耗尽。

研究人员还检查了运动和静止条件下的肌肉表型。随着运动的进行，肌肉糖原含量降低，ATP分解产物（例如无机磷酸盐(Pi)）在ATP含量降低之前积累。在运动能力降低的模型中（即高强度运动中的L-Pck1KO小鼠和低强度运动中的L-GykKO小鼠），运动后肌肉糖原含量减少，而在运动能力增加的模型中（即低强度运动中的L-Pck1KO小鼠、高强度运动中的L-GykKO小鼠和两种强度运动中的LbNOX小鼠），减少没有统计学意义。除了高强度运动后L-Pck1KO小鼠肌肉中ATP水平降低外，肌肉ATP水平与静止小鼠相似，表明它们几乎完全力竭。值得注意的是，在运动能力降低的模型中，运动后肌肉Pi的积累比对照组更大。相比之下，在运动能力增加的模型中，肌肉Pi积累比对照组少。纵向训练 reportedly 诱导肌肉适应，例如增加肌肉糖原含量、脂肪酸氧化和线粒体电子传递链相关酶。另一方面，除了低强度运动中L-Pck1KO小鼠脂肪酸转运蛋白Cd36上调外，与脂肪酸氧化和线粒体电子传递链相关的酶没有变化。总的来说，这些发现表明改变的糖异生对运动条件下的肌肉ATP产生有深远影响，但对静止条件没有影响。

该研究揭示了肝脏利用乳酸和甘油的糖异生分别在高强度和低强度运动的肌肉ATP生产中起主要作用。乳酸通过肌肉糖酵解快速产生，从而迅速达到高血液浓度，匹配短时间内需要大量葡萄糖生产的高强度运动。另一方面，考虑到甘油在脂肪组织中的丰富储存，甘油似乎适合长时间的低强度运动。

从系统视角来看，通过乳酸-葡萄糖碳回收系统（称为Cori循环）的肌肉和肝脏之间的交叉调节高强度运动能力。与我们的结果一致，肝脏特异性敲除线粒体丙酮酸载体2和丙氨酸转氨酶2（损害了PCK1介导的糖异生）据报道会降低运动能力，伴随较低的血糖水平和较高的血乳酸水平。此外，肝脏特异性脯氨酰羟化酶2敲除小鼠中上调的乳酸衍生糖异生据报道增强了高强度运动表现。除了经典认可的高强度运动中Cori循环的重要性外，我们的研究结果表明，对于低强度运动，通过甘油衍生糖异生介导的脂肪-肝脏-肌肉连接至关重要。综合来看，我们目前的结果说明了重要的概念，即肝脏作为器官间网络的枢纽，通过差异调节的利用个体氧化还原依赖性底物的糖异生来维持运动期间的能量代谢。

尽管脂肪酸被认为是肌肉的主要燃料来源，但在我们具有糖异生酶肝脏缺陷的模型中，葡萄糖代谢被认为极大地影响运动能力。此外，考虑到小鼠据报道比人类更依赖糖异生获取循环葡萄糖，糖异生对肌肉ATP生产的贡献可能因物种而异。需要进一步的研究来全面阐明运动期间代谢的细节，并证明其对人类运动的适用性。

如同位素流分析所证明，相互增加的运动能力归因于L-Pck1KO和L-GykKO小鼠中分别增强的甘油和乳酸糖异生。尽管先前的一项研究检查了先天性肝脏特异性PCK1敲除小鼠在运动期间的肝内代谢流与饮食诱导的肥胖，但我们在这里证明氧化还原依赖性糖异生根据运动强度被差异增强，从而调节运动能力。我们进一步表明肝脏胞质[NADH]/[NAD⁺]比率对于决定来自氧化还原依赖性底物的糖异生能力至关重要。有趣的是，肝脏PCK1/GYK缺失降低了胞质[NADH]/[NAD⁺]比率，可能是通过阻断消耗胞质NAD⁺的乳酸衍生或甘油衍生糖异生的流，这反过来通过替代未阻断的氧化还原依赖性途径增强糖异生。这种机制可能具有风险对冲作用，通过补偿性增强替代糖异生途径来预防低血糖，即使一条途径受损。

此外，LbNOX实验表明，降低的肝脏胞质[NADH]/[NAD⁺]比率足以通过促进糖异生来增加运动能力。特别是，糖异生特别在氧化还原依赖性底物供应过量的条件下（即在乳酸或甘油耐受试验和高强度或低强度运动期间）增强，但在稳定条件下（即在静止状态下）则不增强。因此，该系统可能专门响应上调的氧化还原依赖性底物供应而发挥作用，从而避免静止高血糖。最近的研究表明，肝脏是运动期间代谢流的瓶颈，似乎是由于糖异生诱导的分解代谢应激；即TCA循环中间体的损失。因此，降低肝脏胞质[NADH]/[NAD⁺]比率，通过增强氧化还原依赖性底物的流入补充中间体，可能实现运动期间更高效的TCA循环代谢流。

促进运动表现的方法一直从体育和更健康的生活方式干预的角度吸引关注。关于我们发现在促进运动表现方面的适用性，降低肝脏胞质[NADH]/[NAD⁺]比率可能是一种有益的方法，以增强运动能力，无论其强度如何。尽管4-8周的耐力训练据报道将C57BL/6小鼠的运动能力提高了约10-30%，但肝脏LbNOX表达在高强度和低强度运动中分别延长了运动持续时间39%和50%。因此，调节肝脏胞质氧化还原似乎影响运动能力，可能超出了长期训练实现的改善。肝脏胞质氧化还原状态是增强运动表现的有希望靶点。