通过组蛋白乙酰化激活Notch信号通路逆转主动脉瓣膜细胞钙化

本综述揭示了主动脉瓣钙化（CAVD）与瓣膜间质细胞（VICs）衰老及表观遗传改变（如DNA甲基化升高和组蛋白乙酰化降低）的紧密关联。研究创新性提出使用组蛋白乙酰转移酶激活剂SPV106（Pentadecylidenemalonate-1b）可上调Notch1信号，重塑染色质可及性，有效逆转人源VICs的衰老/钙化表型，并在小鼠模型及离体实验中证实其能减轻瓣膜钙化、改善心脏功能，为CAVD的药物治疗提供了靶向表观遗传的新策略。

　　

高剂量维生素D与主动脉瓣衰老和钙化相关

近期临床证据表明，接受维生素D和钙补充剂治疗的患者其主动脉瓣钙化倾向更高。本研究团队此前工作显示，给予小鼠高剂量维生素D可通过衰老依赖机制快速加速主动脉的炎症非依赖性钙化。因此，我们分析了接受高维生素D剂量小鼠的主动脉瓣（AoV）。与接受模拟溶液处理的小鼠相比，维生素D处理的动物在瓣叶连合处和瓣环壁（对应于Valsalva窦）显示出明显的钙化迹象。钙化区域表现出大量间质细胞具有核定位的p21^WAF1/CIP1，这是一种介导细胞周期停滞和细胞衰老的细胞周期蛋白-CDK抑制剂。通过计算机辅助图像分析对瓣叶中p21的表达进行量化，揭示了瓣叶细胞衰老的普遍增加。这些发现建立了瓣膜钙化与细胞衰老之间的直接关联，与动脉中的报道类似。

狭窄性与 insufficiency性VICs的衰老和钙化增加

为了发现具有不同钙化潜能的人瓣膜细胞之间的生物学差异，我们使用了年龄匹配患者的细胞，这些患者因终末期钙化性狭窄或瓣膜关闭不全（一种涉及纤维化和低水平钙化的瓣膜病理）而接受主动脉瓣置换。细胞最初比较了从第1代（p1）到第2代（p2）的倍增时间。来自狭窄瓣膜的VICs（sVICs）与来自关闭不全瓣膜的细胞（iVICs）相比具有更长的倍增周期，并且这与更高水平的细胞衰老相关，如通过β-半乳糖苷酶染色评估所示。在这些传代中，sVICs更高的钙化倾向通过体外钙化试验得到证实。

sVICs的衰老和钙化受表观遗传控制

sVICs更高的衰老水平和增加的钙化倾向并不取决于供体个体的年龄，即所谓的“时序年龄”。因此，我们探讨了两种病理设置中细胞不同衰老水平是表观遗传编程的可能性，例如在血管硬化和钙化中，并反映了“生物衰老”的加速。为此，我们评估了全局DNA甲基化水平，并测量了ELOVL2启动子序列内C5和C7 CpG岛的甲基化水平——这是一个与生物衰老相关的基因。虽然全局DNA甲基化分析显示sVICs与iVICs相比5’-甲基胞嘧啶（5mC）含量增加，但5mC氧化产物5’-羟甲基胞嘧啶（5hmC）的水平变化并未补偿此差异，而对ELOVL2启动子中热点的分析显示iVICs与sVICs相比甲基化变异性更高。线性回归分析表明，两个热点的甲基化是一致的，即使与供体个体的年龄不相关，再次表明细胞生物衰老的患者特异性编程与时序年龄无关。

我们的注意力随后被吸引到可能表征sVICs与iVICs衰老差异的组蛋白修饰上。我们特别绘制了涉及转录激活普遍增加（组蛋白H3赖氨酸9乙酰化和组蛋白H4赖氨酸16乙酰化）、抑制（组蛋白H3赖氨酸20甲基化）以及所谓转录“毒化”（组蛋白H3赖氨酸27三甲基化或乙酰化）的修饰。该分析结果清楚地表明iVICs中激活修饰（例如H3K9Ac, H4K16Ac）过量，并且存在特定抑制标记如H4K20me3的高水平，可能表明失活但具有激活潜能的染色质数量增加。所有这些效应再次与供体年龄无关。为了验证sVICs在表达表观遗传活性酶和染色质重塑因子方面是否与iVICs不同，我们使用通路特异性RT-qPCR阵列分析了从iVICs和sVICs（均在p3且年龄匹配）提取的RNA中编码染色质结构/活性相关表观遗传写入器/读取器的基因表达。无监督层次聚类的结果证明了29个基因的差异表达，这些基因编码参与染色质架构的因子，具有基因抑制（例如PRC1 Polycomb抑制复合物的成员RING1, PHC1, 和 PCGF）、组蛋白H3尾部标记读取（例如 PHF1, -2, -6, -7, -21A/B）和SWI/SNF复合体功能（例如 SMARCA4/BRG1, PBRM1）的特定功能。重要的是注意到，诸如MECP2（参与沉默含有甲基化CpG岛的染色质）或HDAC11（编码具有组蛋白和非组蛋白去乙酰化活性的蛋白）等基因在iVICs中的表达水平低于sVICs。相反，iVICs表达更高水平的NuRD组件MBD3和MTA2（通过sVICs中MTA1的更高表达平衡），以及NSD1（一种对H3K36Me2具有特异性的组蛋白甲基转移酶，参与维持活性染色质）。总之，这些结果表明iVICs中活性染色质或准备转录的染色质程度更高。

SPV106通过重塑染色质可及性和调节Notch表达及功能来减少sVICs的衰老和钙化

先前的工作表明，通过代谢应激诱导衰老的细胞可以通过使用药物（Pentadecylidenemalonate-1b；SPV106）恢复到前衰老状态并恢复生长，该药物通过抑制p300/CBP和激活GCN5/pCAF组蛋白乙酰化酶来诱导全基因组组蛋白乙酰化。因此，我们设定了用该药物减少sVICs衰老的体外治疗方案。在将15μM设定为在p5时减少β-Gal⁺细胞水平最有效的SPV106浓度后，该药物用于评估PCNA和p16的表达、p21的表达以及细胞内钙积累。如图所示，治疗显著减少了sVICs中的衰老标志物和钙化。在p5用SPV106处理sVICs然后药物洗脱直至p7进行的脉冲追踪实验清楚地表明，该药物的衰老抑制功能持续了至少两个传代。最后，证实组蛋白乙酰化对控制VICs衰老过程的相关性，用20μM Garcinol（一种广泛的HAT抑制剂）和ITSA-1（一种HDAC激活剂）处理细胞增加了iVICs以及较低程度的sVICs的衰老水平。

使用低密度RT-qPCR阵列对经SPV106处理或未处理的sVICs提取的RNA进行通路特异性转录组学分析。SPV106处理决定了所分析的243个基因中85个（约35%）表达的显著变化，其中23个基因上调，62个基因下调，并且通过无监督聚类清晰区分了上/下调的基因。列出了最显著富集的通路，指示了上调和下调的基因。具有染色质修饰、重塑和组织功能注释的通路表现出共同上调的基因，如EED、KAT8和KMT2E，它们分别编码参与H3K27单-二-三甲基化的PRC2复合物的组件、对H4K16乙酰化重要的赖氨酸乙酰化酶以及H3K4甲基化读取器，在细胞周期进程和染色质稳定性中很重要。它们包括一系列下调的基因，涉及DNA甲基化（DNMT1, DNMT3A）、组蛋白去乙酰化（HDAC1, HDAC10）以及其他类别的染色质重塑因子，大多与染色质读取、可及性和重塑因子相关（即 BRPF1, BRPF3, CHD4, DOT1L, ING5, SUV39H1）。另一组富集通路表明SUMO化在染色质重塑和细胞衰老中的意义。这些通路的特征是CBX4（编码SUMO E3连接酶）和各种Polycomb PRC1抑制复合物（CBX6, CBX8, PCGF2, PHC2, RING1）的下调。在这些通路中，有趣地注意到BMI1的上调，建立了SPV106可能逆转染色质沉默与减少由CBX4介导的BMI1 SUMO化所表征的DNA损伤反应引起的细胞衰老之间的联系。功能基因组学分析还清楚地表明了促生存通路如那些与PI3K/AKT/PTEN和P53表达相关的通路的参与，伴随PIK3CA（编码PI3K的110 kDa催化亚基的基因）和PIP3信号拮抗剂PTEN的上调。它们还以CARM1、GADD45A、E2F1和ING2/5的调节为特征，这些都参与调节TP53依赖性衰老通路。同样有趣的是观察到两个衰老相关通路的富集，其特征是BMI1和CDKN2A基因（编码p16^INK4a/ARF）的同时上调。鉴于BMI-1在抑制p16启动子中的直接功能，这些结果与SPV106处理增加细胞自我更新一致。最后，从信息学搜索中出现的六个通路表明了Notch1信号在SPV106处理后sVICs表型可能调节中的意义。这些通路的特征是组蛋白去乙酰化酶HDAC1/7/10基因和赖氨酸乙酰转移酶2A（KAT2A）的下调，表明Notch1活性的去抑制可能抑制sVICs的成骨编程。通过RT-qPCR、蛋白质印迹分析和免疫荧光对Notch1以及Runx2和SOX9（两个涉及AoV钙化控制的 crucial Notch1依赖性调控主基因）表达的数据验证显示了SPV106处理的sVICs总RNA中Notch1和Sox9的明显上调以及Runx2的下调。这种以Notch1和Sox9高水平以及Runx2低水平为特征的表达通路也出现在sVICs与iVICs的比较中，表明与文献数据一致，SPV106通过抑制sVICs病理性表型与Notch1和Sox9转录本升高以及Runx2抑制相关，这种表型让人联想到iVICs。最后，用SPV106处理sVICs诱导了Runx2蛋白表达的减少，Sox9核定位的增加，以及Notch蛋白转录活性部分（所谓的Notch细胞内结构域，NICD）核定位的增加，其转录效应通过HAT依赖性乙酰化增强。这一证据表明瓣膜钙化过程存在多层次控制，涉及Notch1的转录上调和NICD的转录激活。

SPV106通过组蛋白乙酰化上调恢复sVICs中组蛋白H3/H4表观遗传设置

在SPV106处理的sVICs中观察到的转录变化伴随着组蛋白H3/H4乙酰化和甲基化标记的明显逆转，达到iVICs的典型水平。值得注意的是，这些变化既与全局DNA甲基化的减少无关，也与ELOVL2 C2/C7年龄敏感CpGs的特异性去甲基化无关。因此，即使SPV106不能作为典型的senolytic药物从培养物和组织中消除衰老细胞和/或基于DNA甲基化状态回溯表观遗传时钟，在我们的实验中，它通过促进与H3K9Ac、H4K16Ac和H4K20me3组蛋白标记相关的转录活性染色质状态的改变，在延缓sVICs衰老/钙化过程中发挥了senomorphic效应。通过ATACseq分析对DMSO和SPV106处理的sVICs染色质进行的研究证实了治疗对染色质可及性的全基因组效应。除了修改近两千个位点的染色质可及性外，对具有更开放或更封闭配置（因此推定更转录活跃或失活）的基因进行GO分析，导致了许多与细胞病理状态一致调节的通路的识别。例如，几个包含在SPV106处理细胞中染色质结构更开放的基因的网络与细胞周期/存活的控制（例如通过TP53和PTEN）或再次与Notch依赖性通路的激活相关，证实了转录组分析发现的转录激活。相比之下，几个包含染色质配置更封闭的基因的网络与Rho信号相关，Rho信号是瓣膜钙化的正调节因子。通过ChIP assay对ATACseq数据进行实验验证，证实了Notch1和Sox9近端启动子区域与含有激活性H4K16Ac而非基因沉默性H4K20Me3修饰的染色质相关。这一结果与先前显示Notch1表观遗传控制对瓣膜病理学相关性的证据一致，并明确指出了pCAF/KAT2B激活剂通过NICD激活抑制VICs衰老和钙化中组蛋白H4乙酰化的直接参与。目前，不可能就其他组蛋白标记的功能意义得出结论，例如H3K27的三甲基化和乙酰化的变化（两种对Notch通路调节具有抗拮作用的组蛋白修饰），以及SPV106治疗对Runx2的负控制。解决这个相关问题将需要特定的实验，例如靶向组蛋白蛋白质组学和/或评估控制瓣膜钙化的互补表观遗传调节通路。

SPV106防止主动脉瓣钙沉积的形成，保护心脏功能

为了验证SPV106对瓣膜钙化的影响，我们采用了两种互补模型。在离体模型中，我们使用了一个微型组织培养系统（MTCS），旨在在心脏自然位置培养主动脉瓣，并将其暴露于病理血流动力学条件和高无机磷酸盐环境中，使用DMSO或相同浓度的SPV106。在第二个模型中，我们采用了维生素D处理方案来评估SVP106的体内效果。为此，根据我们之前的研究，我们在维生素D注射后三天使用浓度为20 mg/kg的SPV106。离体模型的结果显示，SPV治疗组中可检测到瓣叶和主动脉环钙化的瓣膜数量显著减少。此外，使用针对碱性磷酸酶（ALP）和RUNX1/2/3的特异性抗体进行免疫荧光染色定量显示，即使用SPV106处理的瓣膜中成骨承诺减少，尽管钙化的减少与p16⁺和p21⁺细胞水平的变化无关。在体内模型中清楚地观察到主动脉瓣钙化的改善，其中表观遗传药物的施用减少了瓣叶和主动脉环中钙沉积和骨桥蛋白（OPN）（一种参与骨沉积的基质细胞蛋白）的存在。相比之下，SPV106不影响血清OPN浓度（被认为是主动脉瓣狭窄的临床标志物），表明其具有组织特异性而非全身性效应。

除了减少钙化，SPV106还对整体心脏功能和瓣膜运动产生有益影响，如超声心动图评估所检测。例如，维生素D的施用导致射血分数下降，而SPV106的施用防止了这种下降。更直接地关于瓣膜功能的是药物对瓣叶分离的影响（维生素D处理使其减少，与结构更刚性一致，而在接受SPV106的小鼠中得以保留），以及达到峰值速度的时间（维生素D延迟，而表观遗传药物将其恢复到对照水平）。有趣的是，另一个与主动脉瓣钙化相关的参数，即所谓的超声心动图主动脉瓣反向散射（AVBS），直接指代钙化，也被SPV106治疗减少。其他临床相关的瓣膜功能参数，例如Vmax，未受维生素D和维生素D/SPV106治疗的影响，可能是由于我们的方案可检测到的瓣膜钙化早期阶段所致。

研究局限性与结论

据我们所知，本研究首次建立了细胞衰老与人类主动脉VICs钙化潜能之间的直接关系，并通过组蛋白表观遗传景观的改变联系起来。与其他使用动物来源细胞进行的研究相比，我们的工作是用临床特征化的人VICs实现的。然而，我们认识到缺乏合适的对照细胞来进行细胞和分子比较可能是一个局限性。实际上，尽管它们在生物学上与钙化瓣膜细胞不同，但iVICs可能仍然受到某些预先确定的病理编程的影响，这些编程导致与真正初始细胞相比的表观遗传设置改变。支持这一点的是，即使SPV106治疗恢复了在iVICs中发现的组蛋白标记，它并没有减少全局DNA甲基化，也没有减少ELOVL-2基因启动子中年龄敏感CpGs的水平。

研究的第二个局限性可能是我们选择排除最年长供体的细胞，以匹配两个供体组的时序年龄并排除时序年龄作为混淆因素。虽然这可能导致最极端细胞表型的代表性不足，减少了两组之间的生物学差异，但它帮助我们更精确地首次描绘了两种病理的表观遗传设置，并为主动脉瓣狭窄（两种疾病中最普遍且对老年人影响更大的疾病）找到了可能的治疗方法。鉴于缺乏治疗特异性，未来的治疗将必须采用直接瓣膜靶向策略（例如细胞特异性纳米颗粒药物递送）以避免副作用。

最后必须强调，虽然我们的结果与SPV106对抑制糖尿病心脏成纤维细胞细胞衰老和加速皮肤伤口愈合的报道效应一致，但它也与大量表明组蛋白乙酰化减少对VICs钙化编程有积极影响证据相矛盾。第二种可能性来解释这种矛盾是KAT2B/pCAF的激活可能对组蛋白乙酰化/甲基化产生与其它报告中使用的组蛋白去乙酰化酶抑制剂治疗不同的结果，并且除了本研究中揭示的那些之外，额外的表观遗传修饰共同导致SPV106处理的sVICs衰老/钙化表型的减少。应使用染色质分析技术（例如ChIP-Seq或染色质蛋白质组学）进行更结论性的实验来解决这个相关问题。第三种是大多数HDACi研究是用动物来源的细胞进行的，特别是猪VICs。在这方面，可以考虑sVICs对SPV106治疗的反应与HDACi的差异。最后一种可能性是SPV106对KAT2B/pCAF的激活对钙稳态相关基因（如Klotho或FGF23）的表达或功能有直接影响，如文献中在其他细胞类型和体内部分证明的那样。使用参考瓣膜钙化疾病模型和自然衰老动物的研究正在进行中，以区分这些可能性。