多囊蛋白 - 1 调控异位骨化中肌腱源性间充质干细胞命运与细胞外基质构建的关键作用

推荐阅读：本文聚焦异位骨化（HO），发现机械敏感的 CTSK 谱系肌腱源性间充质干细胞（TDMSC）经 PC1 - TAZ 信号轴，影响细胞命运与细胞外基质（ECM）组织，进而调控 HO 进程，为防治 HO 提供新方向，极具科研与临床价值。

　　### 引言
异位骨化（HO）是一种会在软组织中形成异常骨，影响患者关节活动的病理过程，现有研究表明固定治疗可能与细胞外基质（ECM）改变有关，但机械应力在 HO 中的作用机制尚不明确。此前研究虽发现多种细胞可能参与 HO 形成，但具体干细胞类型未知。多囊蛋白 - 1（PC1）是一种机械敏感蛋白，在骨发育等过程有重要作用，不过其在异位骨化和 ECM 组织中的角色也不清楚。本研究旨在揭示机械敏感细胞群体在 HO 中的作用机制，发现 CTSK 谱系肌腱源性间充质干细胞（TDMSC）通过 PC1 - TAZ 轴影响 HO 进程。

结果

1. CTSK 谱系肌腱源性间充质干细胞在跟腱损伤后向成骨和成纤维细胞谱系分化：通过对跟腱损伤后局部组织进行单细胞测序分析，发现与未损伤区域相比，损伤诱导 HO 后，TDMSCs 数量显著增加，且 Ctsk 在跟腱区域间充质干细胞中特异性表达。CTSK⁺细胞在损伤后可分化为成骨和成纤维方向，其表达的成骨和纤维化特征基因显著高于 CTSK^-细胞。构建 CTSK - YFP 谱系追踪小鼠模型进一步证实，CTSK⁺细胞或其分化细胞可形成成骨细胞和 COL3⁺成纤维细胞，表明 CTSK 谱系 TDMSCs 是跟腱损伤后成骨和成纤维细胞谱系的主要来源。
2. CTSK 谱系肌腱源性间充质干细胞群体对机械刺激敏感：对跟腱损伤小鼠进行肢体固定，模拟机械刺激改变，发现固定后 CTSK 谱系细胞数量减少，CTSK⁺ TDMSCs 对机械刺激更敏感，其表达水平随机械条件变化明显。GO 分析显示 CTSK⁺和 CTSK^-细胞群体中多个机械力相关通路发生改变。体内实验表明，固定干预后异位骨化体积减小，胶原纤维数量减少，ECM 排列更紊乱，CTSK⁺细胞衍生的成骨样细胞和表达 CSTK 与 COL3 的细胞数量均下降。体外拉伸应力测试也得到类似结果，应力可增强 TDMSCs 的成骨和成纤维分化。
3. 多囊蛋白 - 1 介导的机械信号影响跟腱损伤后的异常成骨和 ECM 结构：通过 scRNA - seq 分析 CTSK⁺细胞中机械信号转导相关基因表达，发现 Pkd1（编码 PC1）和 Wwtr1（编码 TAZ）基因表达水平较高，且在固定时表达显著下降。Pkd1⁺细胞的成骨和纤维化基因表达增强，且其分化偏向随机械干预条件变化。对 CTSK 谱系追踪小鼠模型进行固定干预，免疫荧光染色显示移动组中多数 CTSK 谱系细胞与 PC1 共定位，固定后显著减少。向 Pkd1^fl/fl小鼠跟腱注射 AAV - Cre 病毒敲除 Pkd1 基因，结果显示异位骨化量减少，ECM 结构紊乱，PC1 蛋白和 OCN⁺成骨细胞表达降低，COL3⁺成纤维细胞数量减少。
4. TDMSCs 中 Pkd1 条件性敲低改变体内异常成骨和 ECM：创建 CTSK⁺细胞条件性 Pkd1 基因特异性敲除小鼠模型（Ctsk - Cre^+/?-Pkd1^fl/fl CKO 小鼠），建立 Burn/ATP 损伤模型后发现，敲除 Pkd1 基因显著减少 HO 形成，使 ECM 排列紊乱，损伤部位的成骨样细胞和新形成的成纤维样细胞数量减少。生成 Prrx1 - Cre^+/?-Pkd1^fl/fl条件性基因敲除小鼠，同样发现 Pkd1 基因敲除会降低 HO 体积，损害间充质细胞的成骨和纤维化分化，导致 ECM 各向异性降低和超微结构变差，表明 PC1 调节 TDMSC 的成骨和纤维化命运以及 ECM 组织。
5. 多囊蛋白 1 通过下游 TAZ 传递机械信号：已知 PC - 1 通过下游转录共激活因子 TAZ 转导机械信号，TAZ 在促进 MSCs 向成骨细胞分化中起重要作用。体外实验中，用 siRNA 沉默 Pkd1 后，肌腱间充质干细胞的成骨活性下降，TAZ 核转位减少。在体内实验中，对 CTSK - YFP 谱系追踪小鼠模型进行 Burn/ATP 损伤建模并分组，免疫荧光染色显示固定组中 CTSK 谱系细胞与 TAZ 共定位，且 TAZ 荧光信号在细胞质中更集中，表明固定抑制 TAZ 核转位。Ctsk - Cre^+/?-Pkd1^fl/fl CKO 小鼠中 TAZ 的核定位也低于对照组。使用 PC1 - CTT 抑制剂 DAPT 进行实验，发现 DAPT 可降低体外肌腱源性间充质干细胞的成骨活性，体内实验中能抑制 HO 形成，减少损伤肌腱中的成骨样细胞和成纤维样细胞数量，抑制 TAZ 向细胞核的定位，表明 PC1 - CTT 裂解诱导的 TAZ 核转位促进 MSCs 的成骨和纤维化分化以及 HO 进展。
6. TDMSCs 中 Taz 条件性敲低改变体内异常成骨和 ECM：将 Ctsk - Cre^+/?小鼠与 Taz^fl/fl小鼠杂交，生成 CTSK⁺细胞条件性 Taz 基因特异性敲除小鼠，建立跟腱损伤模型后分析发现，与 Taz^fl/fl小鼠相比，Ctsk - Cre^+/?-Taz^fl/fl小鼠的 HO 形成显著降低，免疫荧光染色显示其成骨样细胞和成纤维样细胞均减少，TAZ 荧光信号明显降低，ECM 排列紊乱，表明 TAZ 在 CTSK⁺细胞中对 HO 形成和 ECM 组织至关重要，阻断 TAZ 可预防或减轻 HO。

讨论

本研究明确了 PC1 在调节 CTSK 谱系 TDMSCs 命运、ECM 组织和小鼠异位骨化中的关键作用，为预防 HO 提供了新策略。研究证实 CTSK 谱系 TDMSCs 在损伤诱导的 HO 中向成骨和纤维化方向分化，不仅通过直接成骨，还通过修饰 ECM 组织影响异位骨化过程。同时发现固定通过减弱 PC1 - TAZ 信号减少异位骨化和纤维化，抑制或删除 PC1 - TAZ 通路可降低异位骨化和 ECM 形成。不过，本研究存在一定局限性，如未涉及遗传性 HO（FOP），未探究其他参与 HO 形成的细胞，DAPT 治疗方式需优化等。但总体而言，本研究表明 CTSK 谱系 TDMSCs 可通过 PC1 - TAZ 轴影响成骨和 ECM，为治疗或预防异位骨化提供了潜在的药物靶点。

方法

1. 动物使用：实验小鼠为 C57BL/6J 背景，饲养于中南大学实验动物研究中心，实验使用 10 周龄雄性小鼠，所有动物实验经相关委员会批准。Pkd1 - floxed 小鼠、Taz - floxed 小鼠通过 CRISPR/Cas9 技术构建，CTSK - Cre 小鼠和 Prx1 - Cre 小鼠分别由东京大学 S. Kato 和赛业生物提供，通过提取小鼠尾尖基因组 DNA 进行基因分型。
2. Burn/ATP HO 模型：对 10 周龄雄性小鼠进行麻醉，用 27 号针经皮穿刺左侧跟腱多次，然后对 ATP 组小鼠背部进行 60°C 铝块烫伤，诱导部分厚度烧伤损伤，假手术组仅穿刺皮肤不触及跟腱。
3. 关节固定：损伤后立即进行关节固定，使用改造的 1.5mL Eppendorf 管制作固定器，将小鼠腿部固定在足底屈曲和膝关节伸展位置。
4. Micro - CT 分析：解剖小鼠左腿膝关节以下部分，用 4% 多聚甲醛固定后，使用高分辨率 μCT 扫描分析跟腱损伤部位异位骨形成参数。
5. 免疫组化和免疫荧光：获取小鼠损伤后肢体的 HO 原基，固定、脱钙、冷冻保护后进行切片，用于免疫荧光或免疫组化染色，使用特定抗体标记，通过荧光显微镜成像，利用 ImageJ 插件 FibrilTool 分析 ECM 纤维结构的取向和各向异性。
6. 肌腱源性 MSCs 的分离和鉴定：选用 6 - 8 周龄小鼠，切除跟腱后用 I 型胶原酶消化，培养得到肌腱源性 MSCs，取第四代细胞用于实验。
7. 单细胞 RNA - seq 的生物信息学分析：对原始读段数据进行预处理，去除低质量读段、Poly - A 尾和接头序列，将读段映射到参考基因组，进行质量控制、降维和聚类分析，筛选差异表达基因并进行通路富集分析。
8. 实时定量 RT - PCR 和 Western blot 分析：提取标本总 RNA 进行逆转录，通过实时定量 RT - PCR 检测基因表达；对蛋白进行定量后，通过 Western blot 分析蛋白表达，评估核蛋白转位。
9. 定量和统计分析：数据以均值 ± 标准差表示，使用双尾 Student's t 检验比较两组数据，使用单因素或双因素方差分析比较多组数据，P < 0.05 认为差异显著。