耦合Chou-Talalay方法的清凉感生物传感器用于二元清凉剂混合物相互作用模式的定量评估

《Current Research in Food Science》：Cooling Sensation Biosensor Coupled with the Chou-Talalay Method for Quantitative Assessment of Interaction Patterns in Binary Cooling Agent Mixtures

　　

调节清凉感对于提升食品和日化产品的消费者吸引力至关重要。传统方法难以量化清凉感及其协同效应，特别是在模拟人类感知方面。在此，研究人员开发了一种高灵敏度的基于细胞的生物传感器，用于体外清凉感评估。该生物传感器成功定量了薄荷醇、WS-3和WS-23。值得注意的是，将Chou-Talalay方法与该生物传感器相结合，定量研究了这些清凉剂之间的协同和拮抗效应。研究人员的策略表明，相互作用高度依赖于组合和比例；例如，薄荷醇/WS-3 (1:3)显示出显著的协同作用，而某些WS-3/WS-23比例 (1:3)则表现出拮抗作用。感官评估与生物传感器测量结果高度相关，证实了研究人员方法的高预测效度。这种仿生策略为生理相关的清凉感分析确立了新范式。此外，这种集成的生物传感器和Chou-Talalay方法在探索其他味觉分析方面也具有巨大潜力。

清凉感是食品和日化产品中非常理想的特性，能够带来清爽的口感并增强感官愉悦。在过去，研究人员开发了多种清凉剂。最早被商业化生产的薄荷醇因其特有的薄荷香气和高浓度下的灼烧感，在某些产品中的应用受到了限制。为获得更纯粹的清凉感，研究人员合成了WS系列（如WS-3、WS-23）等酰胺类清凉剂。研究表明，清凉剂能激活一系列瞬时受体电位（TRP）通道，其中瞬时受体电位阳离子通道亚家族M成员8（TRPM8）被认为是感知冷刺激和各种清凉剂的关键受体。TRPM8是一种非选择性阳离子通道，其激活会导致阳离子（尤其是Ca²⁺）内流，从而产生电信号并被感知为清凉感。为了评估清凉剂的功效，传统方法如气相色谱-质谱联用技术只能进行定量分析而无法反映生理活性；电子舌技术测量的是一般化学性质而非特定的受体激活；而感官评估则易受主观因素影响。尽管基于受体的细胞生物传感器已成为量化味觉的有效工具，但直接与清凉感生理感知相关的精确体外定量方法仍然缺乏。此外，实际应用中单一清凉剂往往存在风味不佳或效力不足的问题，将不同清凉剂复配使用以实现协同味觉效果成为重要的研究方向，但传统方法难以精确量化不同浓度和比例组合下的相互作用。Chou-Talalay方法是一种基于质量作用定律的数学模型，可通过计算联合指数（CI）和剂量减少指数（DRI）定量评估药物组合的相互作用类型。由于味觉和感觉的产生本质上涉及配体-受体相互作用并符合质量作用定律，该方法理论上适用于风味物质相互作用的研究，但此前尚未在食品风味领域广泛应用。本研究旨在构建一种基于人TRPM8受体的新型清凉感生物传感器，评估薄荷醇、WS-3和WS-23的清凉强度，并利用Chou-Talalay方法定量评估这些清凉剂之间的相互作用，确定产生强协同作用的最佳比例。研究人员得出结论，混合清凉剂之间的相互作用高度依赖于组合方式和配比，例如薄荷醇/WS-3在1:3时表现出显著的协同作用，而WS-3/WS-23在1:3时则表现为拮抗作用。该研究为生理相关的清凉感分析建立了新范式，对开发和优化清凉剂配方具有重要的实践指导意义。本文发表于《Current Research in Food Science》。

研究人员为开展此项研究，主要采用了以下几项关键技术方法：首先，通过质粒转染技术构建了稳定表达人TRPM8受体的HEK293细胞系，并利用免疫荧光和蛋白质印迹验证了受体的表达与定位；其次，采用全自动膜片钳系统记录全细胞电流，功能性地表征了该细胞系对冷刺激的通道激活特性；接着，基于该细胞系构建了清凉感生物传感器，利用钙成像技术检测细胞内Ca²⁺通量的动态变化，从而量化清凉剂引发的受体激活效应；同时，引入Chou-Talalay方法计算剂量-效应曲线、联合指数（CI）及剂量减少指数（DRI）以定量分析二元混合物的协同或拮抗相互作用；最后，使用定量描述分析（QDA）方法对人类感官评估队列（经郑州大学伦理委员会批准及筛选的12名评估员）进行了感官验证。

HEK293-TRPM8细胞的表征
研究人员通过免疫荧光和蛋白质印迹实验证实，TRPM8蛋白成功表达于HEK293细胞的细胞膜区域。通过膜片钳记录全细胞电流发现，随着薄荷醇浓度的增加，在去极化电位下记录到了更大的外向电流，且在1000 μM薄荷醇刺激下，电流密度在+50 mV以上电位时显著高于生理盐水对照组，表现出特征性的浓度依赖性激活和整流特性。这些结果证实了工程化细胞系稳定表达功能性TRPM8通道，适合作为将冷刺激转化为可量化信号的清凉感生物传感器。

清凉感生物传感器的构建与评估
基于细胞内的冷信号转导通路，研究人员以稳定表达TRPM8的细胞作为传感元件，结合钙成像系统作为信号转导器构建了生物传感器。在测试三种典型清凉剂（薄荷醇、WS-23和WS-3）时，加入清凉剂后细胞内Ca²⁺水平迅速上升并达峰。剂量-效应曲线显示，WS-3的半数有效浓度（EC₅₀）最低，薄荷醇最高，表明WS-3产生的清凉效应最强。此外，传感器在15 °C低温下也能被激活，证明了其具有良好的灵敏度和检测限。

二元清凉剂混合物相互作用模式的鉴定
研究人员采用Chou-Talalay方法对三种清凉剂按不同比例（1:3、1:1、3:1）混合后的二元体系进行了定量分析。结果显示，WS-3/WS-23在1:3混合时，在大部分效应水平上表现出明显的拮抗作用；menthol/WS-3在1:3和1:1比例下，在较宽的效应范围内产生了强协同作用，且随着薄荷醇比例增加，相互作用从强协同转变为中度拮抗；menthol/WS-23在大多数混合比例下均观察到协同相互作用，增加薄荷醇比例能增强协同作用。这表明清凉剂的协同效应高度依赖于混合比例和总浓度。

清凉剂剂量减少潜力的评估
通过计算DRI值，研究人员发现剂量减少潜力随效应水平和混合比例的不同而变化。对于WS-3/WS-23，两清凉剂的DRI值随效应水平增加而降低；对于menthol/WS-3，在1:3比例下两物质的DRI值随效应水平增加而上升，而在3:1比例下WS-3的DRI值小于1，表明需要增加剂量；menthol/WS-23在所有比例下的DRI值在整个效应范围内始终大于1，证实了两者之间存在协同作用。

二元清凉剂混合物的感官评估
为验证体外计算结果，研究人员招募了经过筛选的感官评估小组进行感官验证。结果显示，WS-3的清凉强度评分显著高于WS-23和薄荷醇，这与生物传感器的EC₅₀值一致。二元混合物的感官评分验证了前期相互作用模式：WS-3/WS-23混合物的清凉感均有不同程度降低，证实了拮抗性；menthol/WS-3在1:3时获得最高清凉评分，证实了协同性；menthol/WS-23的清凉强度随薄荷醇比例增加而上升。这种强烈的体内外相关性证实了该联合方法的可靠性与预测效用。

总结与讨论部分指出，本研究系统评估了二元清凉剂混合物的协同效应，首次将Chou-Talalay方法应用于清凉剂相互作用分析，精准区分了不同效应水平下的协同、相加和拮抗作用。研究揭示的复杂相互作用具有显著的比例依赖性。此外，从分子机制角度探讨，研究人员推测混合物中不同配体可能结合于TRPM8电压感受器样结构域（VSLD）口袋内的不同位点，或通过诱导不同的构象变化相互影响，甚至通过与磷脂酰肌醇4,5-二磷酸酯（PIP₂）的相互作用增强通道亲和力，从而更有效地稳定通道开放构象，产生更强的清凉感。研究结论表明，本研究成功构建了清凉感生物传感器并结合Chou-Talalay方法评估了三种典型清凉剂二元混合物的协同效应，揭示了依赖于配比的相互作用模式。研究结果深化了关于TRPM8受体多配体结合的理解，为食品和日化行业优化清凉剂配方提供了极具价值的科学指导。