基于质谱技术的类风湿因子深度解析：揭示自身抗体异质性及同种型多样性新视角

本综述系统阐述了运用质谱（MS）技术分析类风湿因子（RF）的创新研究方法，突破传统固相检测（如ELISA）局限，首次在氨基酸水平揭示RF可变区（VR）及高变区（CDR）的肽段表达差异，证实RF(+)类风湿关节炎（RA）患者中存在框架区（FR）和de novo肽段富集现象，并发现IgA、IgG等同种型在血清阴性RA中的潜在表达，为RF的精准分型及RA病理机制研究提供新方向。

　　

引言

类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA）是一种以关节炎症为特征的慢性自身免疫性疾病，在欧洲约1%的人群受累。若不及时治疗，严重的关节炎症或破坏会导致身体功能受损甚至劳动能力丧失。类风湿因子（Rheumatoid Factor, RF）和抗环瓜氨酸肽抗体（anti-CCP）是RA的重要生物标志物，并被纳入美国风湿病学会（ACR）和欧洲抗风湿病联盟的分类标准。然而，约三分之一RA患者（血清阴性RA）缺乏这两种抗体，限制了其在诊断和预后中的应用。RF不仅有助于诊断，还预示更严重的疾病进程，RF阳性患者相较于阴性患者具有更高的放射学损伤和全身受累风险。

RF是多克隆自身抗体，靶向免疫球蛋白G（IgG）的恒定Fc部分。临床实验室中，RF通常通过比浊法或乳胶凝集法检测，这些方法无法区分不同同种型。而固相检测法如酶联免疫吸附测定（ELISA）和荧光酶免疫测定（FEIA）能够检测同种型特异性RF。IgM是最常见的RF同种型，其次是IgG和IgA。尽管当前标准化RF检测方法已有应用，但其特异性低、标准化程度差，存在改进空间。

目前对多克隆自身抗体（包括RF）的抗原结合（Fab）区域了解甚少。免疫球蛋白（Ig）可变域中的氨基酸序列变异主要集中于三个高变环，即互补决定区（CDRs），它们通过形成与抗原表位互补的表面来决定抗原特异性。抗体多样性源于B细胞发育过程中的VDJ重组、连接多样性和体细胞超突变。

本研究旨在通过质谱技术深入探究RA患者中RF的蛋白水平特性，突破传统单次固相检测的局限，实现RF同种型区分及序列分析，为表征未收录于人类蛋白质组数据库的RF可变区序列提供新机遇。

材料与方法

研究获鲁汶大学医院伦理委员会批准（S65091）。纳入患者为来自CareRA队列（S51411）的未使用疾病修饰抗风湿药（DMARD）的早期RA患者，RA诊断基于1987年ACR分类标准。疾病对照组为经风湿病学检查排除自身炎症或自身免疫疾病的患者。RF通过比浊法测定。

试剂包括人Fc IgG1、Tris-HCl、二硫苏糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAM）、尿素、Lys-C内切蛋白酶、糜蛋白酶、甲酸和乙腈等。

RF富集过程使用Fc IgG1包被的微孔板，血清稀释后加入孔板，经孵育和洗涤后，进行还原、烷基化和酶切消化。肽段经脱盐处理后，进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。

生物信息学分析使用Progenesis软件进行相对定量，Mascot和PEAKS Studio进行肽段鉴定和de novo测序。通过IgBLAST和IMGT/DomainGapAlign算法将肽段序列与胚系序列比对，并分配至框架区（FR）或CDR。

统计分析采用Kruskal-Wallis检验及事后Dunn检验，使用PCA和稀疏偏最小二乘判别分析（sPLS-DA）识别最具预测性的肽段。

结果

概念验证实验

首次实验包含12例样本：4例RF(+)/anti-CCP(+) RA患者、4例RF(?)/anti-CCP(?) RA患者和4例疾病对照。PCA显示RF阳性样本与阴性样本分离，但RF(+)组内肽段表达高度异质。sPLS-DA表明三组患者可分别聚类。

RF同种型分布显示，在血清阴性RA患者中，低丰度的IgG1-RF、IgG2-RF、IgG3-RF和IgM-RF被检出。IgA-RF仅在RF阳性样本中检测到，而在血清阴性RA或对照组中未发现。

主要实验

第二次大规模实验纳入86例样本，包括28例RF(?)疾病对照、4例RF(+)疾病对照、22例RF(?)/anti-CCP(?) RA患者、27例RF(+)/anti-CCP(+) RA患者和5例RF(?)/anti-CCP(+) RA患者。PCA和sPLS-DA再次证实RF(+) RA患者与对照组分离，且RF(?) RA患者也呈现与对照组不同的聚类趋势。

火山图分析显示，与RF(?)疾病对照相比，RF(+)/anti-CCP(+) RA患者中有450个肽段表达上调（调整后p值<0.05，FC > 5），RF(?)/anti-CCP(?) RA患者中有146个肽段上调。其中61个上调肽段经de novo测序鉴定，15个被分配至可变区。143个上调肽段通过Mascot数据库搜索被定位至免疫球蛋白可变部分，多数位于框架区或框架区与CDR交界处。

sPLS-DA识别出13个位于免疫球蛋白可变区的判别肽段，这些肽段在RA患者组中丰度最高，且其中3个肽段（QVQLVESGGGLVK、PGQAPRLL和SLSPGERATL）在概念验证实验中也得到交叉验证。

另有63个特征在两次实验中均上调，但未能通过数据库搜索或de novo测序鉴定序列，提示它们可能为CDR相关但尚未识别的肽段。

RF同种型分析

Z-score热图和曲线下面积（AUC）分析显示，所有同种型在RF(+)/anti-CCP(+) RA组中的丰度均显著高于RF(?)/anti-CCP(?)对照组。除IgG1外，所有同种型在RF(+)/anti-CCP(+) RA组中的丰度均显著高于RF(?)/anti-CCP(?) RA组。IgM同种型在RF(+)/anti-CCP(+) RA组与RF(+)/anti-CCP(?)对照组间无显著差异。所有四种IgG同种型（非IgM）在RF(?)/anti-CCP(+) RA组中的丰度均高于RF(?)/anti-CCP(?)对照组，且IgG2在RF(?)/anti-CCP(+) RA组中的丰度高于RF(?)/anti-CCP(?) RA组。

讨论

本研究通过质谱技术成功表征RF，发现RA患者与对照组在Ig相关肽段表达上存在显著差异。框架区序列在血清阳性RA患者中富集，且部分可变区相关肽段在血清阴性RA组中也有表达，但未见于对照组。由于de novo测序的技术限制，RF特异性CDR序列的数据仍有限。

研究发现非IgM-RF同种型存在于血清阴性患者中，9.1%的RF(?)/anti-CCP(?) RA患者IgM-RF阳性，相当一部分患者弱阳性表达IgG1-RF。IgA1-RF主要见于RF(+) RA，表明IgA-RF可能对RA更具特异性并参与病理过程。

当前缺乏针对不同疾病CDR的蛋白质序列数据库，限制了CDR肽段的准确鉴定。标准数据库搜索发现143个在主要实验中上调的Ig可变区肽段，其中22个在概念验证实验中上调，重叠较少可能源于样本量限制。

研究局限性包括未纳入其他RF阳性炎症疾病（如系统性红斑狼疮或干燥综合征）样本，且初始实验样本量较小可能影响统计效能。

总之，RF自身抗体的性质复杂，当前临床免疫测定法特异性低、标准化差，难以全面捕捉其复杂性。质谱分析及de novo测序技术的进步将促进RF的更精准表征，为临床检测提供新路径。