基于单细胞ICP-MS技术探究银纳米颗粒在人红细胞中的摄取行为与异质性分析

本研究针对纳米颗粒生物效应评估中细胞群体异质性被忽视的难题，开发了基于单细胞电感耦合等离子体质谱（SC-ICP-MS）的分析方法，首次实现了对暴露于银纳米颗粒（AgNPs）的人红细胞（RBCs）进行单细胞水平的定量分析。研究系统考察了暴露时间（8/12/24 h）和纳米颗粒尺寸（20/40 nm）对摄取行为的影响，发现AgNPs在红细胞群体中的摄取呈现显著的时间依赖性和细胞间异质性，为纳米毒理学研究提供了重要的方法学支撑和机制见解。

　　

随着纳米技术的飞速发展，银纳米颗粒（AgNPs）因其卓越的抗菌、抗病毒特性以及良好的化学稳定性，被广泛应用于医疗器械涂层、药物递送、纺织品、化妆品乃至食品包装等众多领域。这种无处不在的应用也使得人类接触AgNPs的机会显著增加。然而，这些微小的颗粒进入人体后究竟会对我们的细胞产生怎样的影响？它们是如何与细胞相互作用的？这些关键的科学问题至今尚未完全阐明。传统的毒理学研究方法通常将大量细胞作为一个整体进行均质化处理，然后测量其总体的纳米颗粒含量，这种方法虽然能提供平均效应，却完全掩盖了细胞个体之间的差异。事实上，即使是基因型相同的细胞群体，在应对环境刺激时也可能表现出截然不同的反应，这种细胞间的异质性在纳米颗粒与细胞的相互作用中可能扮演着至关重要的角色。因此，发展能够在单细胞水平上对纳米颗粒的摄取、分布和含量进行精确分析的技术，对于准确评估纳米材料的生物安全性和理解其作用机制具有迫切的必要性。

正是在这一研究背景下，一篇发表在分析化学权威期刊《Talanta》上的研究论文，为我们打开了窥探单细胞内部纳米世界的新窗口。该研究由Ana Justo-Vega等人完成，他们首次将单细胞电感耦合等离子体质谱（SC-ICP-MS）这一前沿分析技术应用于探究AgNPs与人红细胞（RBCs）的相互作用。红细胞作为血液中数量最丰富的细胞，承担着氧气运输等重要功能，是研究纳米颗粒血液循环暴露的理想模型。本研究旨在回答几个核心问题：AgNPs能否被红细胞摄取？这种摄取是否随时间变化？不同尺寸的AgNPs（20 nm vs. 40 nm）其摄取行为有何不同？更重要的是，在单细胞水平上，这种摄取在细胞群体中是如何分布的？是否存在显著的异质性？

为了回答这些问题，研究人员设计了一套严谨的实验方案。关键技术方法主要包括：首先，从健康志愿者捐献的血液中分离并固定人红细胞。接着，将红细胞与两种不同尺寸（20 nm和40 nm）的AgNPs在两种浓度比例（细胞:NP ≈ 1:1 和 1:50）下分别孵育8、12和24小时。孵育后，通过离心清洗去除未结合的AgNPs，获得细胞样本。核心分析技术是SC-ICP-MS，该方法通过特殊的进样系统（如高效雾化器和低流量进样）将单个细胞依次送入高温等离子体中完全电离，通过检测特定元素（如银，Ag）产生的瞬时信号脉冲（称为“细胞事件”）来识别含有该元素的细胞，并根据信号强度计算出每个细胞内的元素质量。此外，研究还辅以透射电子显微镜（TEM）对细胞切片进行观察，以直观确认AgNPs在细胞内的存在和定位。

3.1. 可行性研究

研究人员首先使用20 nm AgNPs在高浓度暴露（细胞:NP = 1:50）条件下进行了可行性验证。SC-ICP-MS分析成功检测到了含有银信号的红细胞，证实了AgNPs能够与红细胞发生关联。结果显示，随着暴露时间从8小时延长到12小时，检测到的含银红细胞数量以及细胞内的银质量均有所增加，但在24小时时未观察到进一步显著增加。对离心后上清液的分析发现，随着细胞对AgNPs摄取的增加，上清液中游离的银浓度相应下降，提示细胞的存在可能对AgNPs有一定的稳定作用。SC-ICP-MS的时间分辨信号图清晰显示，暴露组红细胞样本中出现大量明显的银信号脉冲，而对照组则没有，确证了检测信号的特异性。

3.2. 剂量浓度和孵育时间的影响

接下来，研究系统地考察了40 nm AgNPs在不同暴露条件（低剂量1:1和高剂量1:50）下的摄取情况。低剂量暴露下，即使经过24小时孵育，红细胞的AgNPs摄取量也极低，难以准确定量。而在高剂量（1:50）暴露下，则观察到了明显的时间依赖性摄取。随着暴露时间从8小时增加到24小时，红细胞群体中银的总质量浓度显著上升。更重要的是，SC-ICP-MS揭示了一个关键现象：并非所有红细胞都同等程度地摄取AgNPs。在8小时和12小时暴露后，大约只有20%的红细胞检测到含有银，即使延长暴露时间至24小时，这个比例也仅升至约25%。这意味着大部分红细胞（75%-80%）在此实验条件下并未积累可检测量的AgNPs。对于那些摄取了AgNPs的细胞，其摄取量也并非均一。通过计算每个细胞内的AgNPs数量，研究发现平均摄取量随暴露时间增加：8小时后约为3个AgNPs/细胞，12小时后约为5个AgNPs/细胞，24小时后则达到约8个AgNPs/细胞。银质量分布直方图进一步直观展示了细胞群体的异质性：分布曲线呈现明显的右拖尾特征，说明大部分细胞聚集在较低的摄取量区间，但有一小部分细胞摄取了远高于平均水平的AgNPs，且这种异质性在24小时暴露组最为显著。透射电子显微镜（TEM）图像为SC-ICP-MS的结果提供了形态学证据，在红细胞切片中可以清晰地观察到高电子密度的、尺寸与所用AgNPs相符的黑色颗粒。

3.2.1. 纳米颗粒尺寸对AgNPs-RBCs关联的影响

研究还比较了20 nm和40 nm AgNPs在相同细胞:NP比例（1:50）下的摄取差异。结果发现，尺寸效应非常显著。对于较小的20 nm AgNPs，随着暴露时间延长，能够摄取AgNPs的红细胞比例急剧增加，从8小时后的40%增加到12小时后的114%（可能由于计数误差或细胞聚集导致超过100%），表明几乎所有的细胞都参与了摄取。然而，有趣的是，尽管摄取AgNPs的细胞比例大幅增加，但每个细胞平均摄取的AgNPs数量却相对稳定，始终维持在约2个/细胞左右。这与40 nm AgNPs的结果形成了鲜明对比：40 nm AgNPs是少数细胞（约25%）摄取了较多颗粒（且数量随时间增加），而20 nm AgNPs是多数甚至全部细胞都摄取了少量颗粒（且数量不随时间显著变化）。这表明纳米颗粒的尺寸是调控其与细胞相互作用模式和分布异质性的一个关键因素。

本研究成功论证了SC-ICP-MS技术在定量分析纳米颗粒与细胞相互作用方面的强大能力。其主要结论是：AgNPs在人红细胞中的摄取是一个受暴露时间和纳米颗粒尺寸显著影响的、高度异质性的过程。SC-ICP-MS能够揭示传统群体平均方法所无法发现的细胞间差异，例如仅有部分红细胞会摄取40 nm AgNPs，且摄取量分布极不均匀。这些发现强调了在纳米毒理学和生物医学应用中，必须考虑细胞群体的异质性，而非简单地依赖平均数据。该研究建立的方法为未来在更复杂的细胞模型和组织中精确追踪纳米颗粒的命运和行为奠定了坚实的基础，对于评估纳米材料的安全性、优化纳米药物递送系统以及理解纳米-生物界面相互作用机制都具有重要的科学意义和应用价值。