基于类芬顿反应耦合环介导等温扩增的病原体比色检测新方法

本刊推荐：本研究创新性地将类芬顿反应（Fenton-like reaction）与环介导等温扩增（LAMP）技术耦合，开发了一种高灵敏度（检测限达10?5 ng/μL）、可视化的病原体检测平台。该技术通过羟基自由基（•OH）与DNA扩增产物的竞争反应保护偶氮染料苋菜红（amaranth），实现"红-无色"的直观颜色转变，为资源有限地区的病原体POCT（point-of-care testing）提供了无需复杂仪器的解决方案。

　　

亮点

比色检测原理

图1展示了通过类芬顿反应进行比色检测的整体工作流程和原理。该过程从细菌DNA提取开始，接着进行LAMP扩增。扩增完成后，增加的DNA分子数量使得比色检测成为可能。

比色检测通过向扩增后的DNA中加入苋菜红和类芬顿试剂（H₂O₂ 和 CuSO₄）来启动。检测原理依赖于H₂O₂和CuSO₄之间的类芬顿反应产生的羟基自由基（•OH）。这些自由基可以降解苋菜红（一种发色分子）中的偶氮键，使苋菜红的红色变为无色。然而，当存在LAMP扩增产物时，DNA会与羟基自由基发生竞争性反应，从而减少羟基自由基对苋菜红的影响，保持其固有的红色。

材料

过氧化氢（H₂O₂, 37%）、五水合硫酸铜（CuSO₄·5H₂O, ≥98%）和苋菜红购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯市，纯度85–95%）。LAMP试剂，包括Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶、25 mM的MgCl₂、10×等温扩增缓冲液和dNTP混合物购自New England Biolabs（美国马萨诸塞州伊普斯维奇）。LB低盐肉汤购自MBcell（韩国首尔）。琼脂糖粉（凝胶强度（1%）：>1000 g/cm2，未检测到... [此处材料列表可能不完整]

苋菜红体积和浓度的优化

图2展示了苋菜红体积和浓度优化的结果。为了实现类芬顿反应在比色检测中的应用，首先优化了这两个参数。本实验中，从屎肠球菌培养物中提取DNA，并用作LAMP反应的模板。随后，通过加入2 μL H₂O₂（0.35%）、1 μL CuSO₄（100 mM）以及不同体积（3, 5, 和7 μL）和浓度...的苋菜红来监测LAMP扩增产物。

结论与未来展望

在本研究中，我们成功开发了一种使用类芬顿反应耦合LAMP扩增技术进行病原体比色检测的方法。所得结果证明了应用类芬顿反应耦合LAMP进行屎肠球菌和单核细胞增生李斯特菌比色检测的潜力。确定了类芬顿试剂的最佳浓度为100 mM CuSO₄、0.37% H₂O₂和1 mg/mL苋菜红。引入的比色检测可用于...