利用多种稳定同位素示踪剂和HPLC-(ID)-ICP-MS技术追踪菠菜（Spinacia oleracea）中硒化合物的代谢过程

《Analytica Chimica Acta》：Tracking the metabolisms of selenium compounds in Spinacia oleracea by using multiple stable isotopes tracers and HPLC-(ID)-ICP-MS

本研究利用76SeMet、77Se(IV)和Ch-SeNPs三种同位素示踪剂，通过 foliar 补充法探究菠菜中硒的积累、代谢转化及其对锌、铁、钼含量的影响。结果表明，三种硒源均被有效吸收并转运至根部，76SeMet和77Se(IV)主要转化为硒甲硫氨酸（SeMet），而Ch-SeNPs在叶片中部分保留纳米颗粒形态。硒补充显著提升叶片叶绿素a和总叶绿素含量（分别增加800±50和1200±80 mg kg?1 DW），同时增加锌和铁含量，但降低根部钼含量。通过结合同位素稀释质谱和高效液相色谱-电雾质谱联用技术，首次实现了三种硒形态代谢转化的同步追踪与定量分析。

　　硒作为一种微量元素，在农业和营养领域具有重要价值，它在人类和动物体内扮演着抗氧化防御和甲状腺功能调节的关键角色。尽管硒并非普遍被认为是植物生长所必需的，但研究表明，低浓度的硒可以为植物提供诸多益处，例如促进生长、增强抗逆性以及减轻氧化应激。然而，过高的硒浓度可能引发毒性反应，从而影响植物健康和食品安全。植物主要通过土壤获取硒，其在土壤中的可利用性及化学形态受多种因素影响，如土壤pH值、氧化还原电位、有机质含量和微生物群落。其中，硒酸盐（Se(VI)）和亚硒酸盐（Se(IV）是植物中最易吸收的两种形式，它们分别通过硫酸盐转运蛋白和磷酸盐转运蛋白进入植物体内。这些差异的吸收机制影响了硒在植物组织中的积累和分布，进而影响其潜在的毒性或有益效果。近年来，硒纳米颗粒（SeNPs）因其较低的毒性、可控释放特性和在植物系统中代谢的环境友好性，成为农业应用中的新型硒形式。研究指出，SeNPs可能比传统的硒酸盐或亚硒酸盐更有效地促进植物生长和抗逆性，为可持续的硒生物强化开辟了新的途径。

为了更深入地理解植物中硒的代谢过程，使用硒同位素示踪剂成为一种有力的研究手段。这种方法允许同时引入和评估不同硒形式在植物生长介质中的行为，不仅能够追踪源自不同硒前体的代谢产物，还便于比较吸收速率、转运、形态转化及潜在的竞争机制。尽管在小鼠和环境样本（如土壤和沉积物）中已成功应用了同位素示踪方法，但其在植物中的应用仍较为有限。目前，最常用的分析技术是电感耦合等离子体质谱（ICP-MS），而使用高富集稳定同位素标记的硒示踪剂可以显著提高ICP-MS和HPLC-ICP-MS的检测信息，即使在低浓度下也能提供可区分的信号。这种策略提升了检测和量化总硒及不同硒物种的精确度，使得在单次实验中能够同时评估总硒含量和源自不同前体的硒物种。因此，将代谢示踪剂、ICP-MS、HPLC-ICP-MS以及同位素稀释质谱（IDMS）相结合，为研究植物中硒的动态变化提供了强有力的方法。

本研究以菠菜（*Spinacia oleracea*）为模型植物，因其易于栽培且其地上部分可食用。采用水培系统，同时对菠菜进行叶面施用三种不同形式的硒：两种同位素标记的硒（^76SeMet和^77Se(IV)）以及一种天然富集形式的壳聚糖修饰硒纳米颗粒（Ch-SeNPs）。研究的主要目标包括：评估硒对光合色素的影响；利用ID-ICP-MS量化各硒物种的积累；通过后柱ID-HPLC-ICP-MS和HPLC-ESI-MS/MS确定源自不同前体的硒物种；以及分析硒对其他必需元素的摄取影响。通过这种综合方法，研究人员能够全面了解硒在植物系统中的动态行为。

研究结果显示，硒补充显著提高了菠菜中叶绿素a（800 ± 50 mg kg^-1 DW）和总叶绿素（1200 ± 80 mg kg^-1 DW）的含量。ID-ICP-MS分析表明，Ch-SeNPs和^76SeMet在植物的地上部分被优先吸收（分别占总硒的40%和31%），而^76SeMet和^77Se(IV)则被迅速转运至根部（分别占总硒的43%和36%）。ID-HPLC-ICP-MS进一步揭示了在叶绿体和根部中，^76SeMet和^77Se(IV)的主要物种为SeMet，而Ch-SeNPs在叶部中以SeMet和未知的硒化合物为主，而在根部中则以Se(VI)和SeMet为主。在韧皮部汁液分析中，^76SeMet的主要物种为SeMet，^77Se(IV)的主要物种为Se(IV)，而Ch-SeNPs则主要为未知化合物。此外，硒还提高了菠菜地上部分和根部中锌（Zn）和铁（Fe）的含量，同时降低了根部中钼（Mo）的浓度。

研究还发现，尽管硒的叶面施用对植物的形态和生理参数（如根长和生物量）没有显著影响，但部分叶面出现叶黄素（chlorosis）症状，表明硒可能干扰某些必需营养素的吸收，进而引发植物的应激反应。此外，不同形式的硒在植物组织中的积累比例存在差异，Ch-SeNPs在叶部中积累较高，而SeMet则在根部中表现更优。然而，Ch-SeNPs在植物组织中以纳米颗粒形式存在，这可能带来食品安全问题。相比之下，SeMet和Se(IV)在叶部和根部中均被代谢为SeMet，显示出较高的生物转化能力。

为了进一步研究这些硒物种的转化过程，研究人员使用了酶解法提取样品，并通过HPLC-ICP-MS和HPLC-ESI-MS/MS分析其在植物不同组织中的分布。结果表明，酶解过程能够有效提取硒物种，并通过同位素稀释法量化其浓度。同时，HPLC-ESI-MS/MS分析确认了SeMet、SeMetO（硒甲硫氨酸氧化物）和SeMetSeCys（硒甲基硒半胱氨酸）的存在。此外，研究还发现，Ch-SeNPs在植物中部分转化为未知化合物，但其在根部中未被显著转化，这可能与其在植物体内的稳定性有关。

研究还评估了硒对其他必需元素（如Cu、Fe、Mo和Zn）的影响。结果表明，硒的施用显著提高了地上部分和根部中Zn和Fe的含量，而Mo的含量在根部中则显著下降。Cu的含量在两种组织中均未发生变化。这些变化可能与硒对植物营养元素平衡的影响有关，进而影响其抗氧化系统。此外，硒的施用方式和化学形式也会影响其对其他元素的吸收和分布。例如，之前的研究表明，Ch-SeNPs在某些植物中可能导致Zn含量下降，而在其他植物中则可能提高Zn和Cu的含量。这些结果进一步说明，硒对植物营养元素的影响具有一定的物种特异性。

本研究的创新之处在于，首次在菠菜中应用了三种同位素标记的硒形式，使得在单次实验中能够同时评估不同硒形式的积累和代谢转化。这种方法不仅提高了检测的精确性，还为未来研究植物硒代谢路径提供了新的思路。此外，研究结果表明，SeMet是菠菜中最主要的代谢产物，无论其来源于哪种形式的硒。因此，SeMet可能成为叶面施肥的理想选择。相比之下，Ch-SeNPs由于其在植物组织中的稳定性，可能限制其作为硒肥料的适用性。而Se(IV)在叶部和根部中均表现出一定的代谢能力，但其在根部中的转化比例较低。

综上所述，本研究通过综合运用多种分析技术，揭示了不同形式的硒在菠菜中的积累和代谢转化特性，为硒在植物中的应用提供了科学依据。同时，研究还强调了在考虑硒形式和施用方法时，对植物营养元素平衡和食品安全的重要性。这些发现不仅有助于优化植物营养管理，还为开发更安全有效的硒肥料提供了新的方向。