人类肿瘤中亚细胞空间转录组技术平台的系统性基准测试研究

《Nature Communications》：Systematic benchmarking of high-throughput subcellular spatial transcriptomics platforms across human tumors

本研究针对当前高分辨率空间转录组(ST)技术缺乏系统性评估的问题，研究人员通过对结肠腺癌、肝细胞癌和卵巢癌样本进行多平台平行测试，结合CODEX蛋白组学和scRNA-seq参考数据，系统评估了Stereo-seq v1.3、Visium HD FFPE、CosMx 6K和Xenium 5K四大平台的性能。研究发现Xenium 5K在检测灵敏度、特异性及细胞分割准确性方面表现最优，为肿瘤微环境研究提供了重要技术指导。该研究为空间转录组技术的选择和应用建立了标准化评估框架，相关数据集已通过SPATCH平台开放共享。

　　

在生物医学研究领域，空间转录组技术近年来取得了突破性进展，成功将基因表达信息与组织空间位置相结合，为理解细胞状态、细胞间相互作用和组织结构提供了前所未有的视角。然而，随着该技术的快速发展，市场上涌现出多种高分辨率、高通量的空间转录组平台，它们在捕获效率、转录本扩散控制、空间分辨率等方面各有特点，研究人员在选择合适平台时面临巨大挑战。尽管已有一些研究对不同的空间转录组技术进行了比较，但这些评估多集中于空间分辨率较低或基因面板较小的技术，且往往使用在不同实验条件下生成的公共数据集，缺乏一致的真实参考数据，导致对最新技术进展的理解不够全面。

为了填补这一空白，由北京大学彭飞任、张瑞等研究人员领导的研究团队在《Nature Communications》上发表了最新研究，系统性地对四种商业化高通量亚细胞分辨率空间转录组平台进行了基准测试。该研究收集了结肠腺癌(COAD)、肝细胞癌(HCC)和卵巢癌(OV)患者的治疗初治肿瘤样本，通过制备连续组织切片，在同一批样本上平行运行Stereo-seq v1.3、Visium HD FFPE、CosMx 6K和Xenium 5K四种平台，并利用CODEX对相邻切片进行蛋白质组学分析，同时对相同样本进行单细胞RNA测序(scRNA-seq)，建立了全面的真实参考数据集。

研究团队采用多维度的评估框架，从分子捕获效率、转录本背景噪声与扩散控制、转录本识别与定位准确性、单细胞分割、细胞聚类与注释、空间聚类以及空间通路富集等多个方面，全面评估了各平台的性能。评估过程中，研究人员还进行了手动核分割和详细注释，确保了评估结果的可靠性。

关键技术方法方面，研究团队收集了三种癌症类型（结肠腺癌、肝细胞癌和卵巢癌）的患者肿瘤样本，制备了福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)和新鲜冷冻(OCT包埋)组织块。对四种空间转录组平台（Stereo-seq v1.3、Visium HD FFPE、CosMx 6K和Xenium 5K）进行了平行测试，同时对相邻组织切片进行CODEX多蛋白标记分析，并对相同样本进行单细胞RNA测序。数据分析包括图像配准、细胞分割、细胞类型注释和空间聚类等多种生物信息学方法。

分子捕获效率评估

研究首先评估了各平台对标记基因的检测灵敏度。在8μm分辨率下（近似小免疫细胞直径），Xenium 5K在多个标记基因中表现出卓越的灵敏度。通过将ST数据与scRNA-seq数据进行基因水平相关性分析，发现Stereo-seq v1.3、Visium HD FFPE和Xenium 5K与scRNA-seq具有高度相关性，而CosMx 6K尽管检测到的转录本总数较高，但其基因水平转录本计数与scRNA-seq参考存在显著偏差。在选定区域（400×400μm）内，Visium HD FFPE在转录本检测能力上优于Stereo-seq v1.3，而Xenium 5K在HCC中灵敏度高于CosMx 6K。

转录本背景噪声与扩散控制

对于成像基础的空间转录组(iST)平台，研究人员评估了阴性探针和代码产生的背景信号。CosMx 6K检测到的转录本总数较高，但空间变异较小，阴性对照信号较强，表明存在较高的背景干扰。Xenium 5K在归一化后显示出较低比例的阴性对照信号，背景噪声控制更优。在测序基础的空间转录组(sST)平台中，Visium HD FFPE比Stereo-seq v1.3能更有效地控制转录本扩散，显示出更少的组织外转录本。

转录本识别与定位准确性

利用相邻切片的CODEX蛋白质组学数据作为高分辨率参考，研究人员评估了各平台的转录本定位准确性。在三级淋巴结构(TLS)和血管结构等特定区域，Visium HD FFPE和Xenium 5K显示出与CODEX更强的空间一致性。通过计算空间网格上ST衍生特征（单个标记基因表达、细胞类型特异性基因特征和细胞类型丰度）与CODEX推断细胞计数之间的相关性，发现Visium HD FFPE和Xenium 5K的整体一致性高于Stereo-seq v1.3和CosMx 6K。

单细胞分割比较

细胞分割准确性对单细胞水平分析至关重要。CosMx 6K和Xenium 5K基于多通道染色图像进行细胞分割，而Stereo-seq v1.3通过将核掩模扩展5μm来估计细胞边界。与手动核分割结果相比，CosMx 6K和Xenium 5K的自动细胞分割结果更接近手动识别的细胞数，分割准确性更高。Xenium 5K在细胞边界内保留了更高比例的转录本，表明其转录本分配更有效。此外，Xenium 5K更好地减少了互斥标记基因对（如EPCAM与CD3E/CD68）在同一细胞中的共表达，表明其单细胞分割性能更优。

细胞聚类与细胞类型注释

在细胞聚类分析中，scRNA-seq由于其更高的分辨率和灵敏度，提供了最有效的细胞状态分离。在空间转录组平台中，iST平台因其更高的空间分辨率而表现出更好的聚类性能。在细胞类型注释方面，Xenium 5K在五种注释工具中表现出一致的注释结果，显示出更好的注释稳健性。与CODEX参考数据相比，Xenium 5K在识别免疫细胞（如CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞和B细胞）方面表现出最高的整体一致性，而各平台在上皮细胞检测方面表现相当。

空间聚类与空间通路富集

在空间聚类方面，各平台均能较好地重现CODEX观察到的大规模组织模式，与CODEX的聚类一致性相当。空间聚类成功识别了定位于肿瘤核心或边界的恶性细胞，其中Visium HD FFPE和Xenium 5K描绘了更连续的肿瘤边界。在通路富集分析中，Xenium 5K在免疫浸润区域与肿瘤区域之间以及肿瘤区域与正常区域之间识别出最多数量和比例的差异表达基因(DEGs)。基因本体(GO)通路富集分析显示，各平台在识别生物学相关通路上存在差异，Xenium 5K检测到的显著富集通路数量最多。

研究结论表明，在技术层面，sST和iST平台各具优势。Visium HD FFPE在转录本检测灵敏度和特异性方面优于Stereo-seq v1.3，而Xenium 5K在基因水平与scRNA-seq的相关性、背景信号控制以及与CODEX蛋白质图谱的空间一致性方面优于CosMx 6K。在下游分析中，Xenium 5K在细胞类型注释准确性方面表现最佳，能有效描绘特定细胞类型的精细空间组织。多通道成像的使用通过更精确的细胞边界划分和多核细胞识别，提高了注释准确性。

该研究的重要意义在于为空间转录组技术的选择和应用提供了实用指导。对于需要高精度细胞状态推断的应用，如细胞间通信网络推断，iST平台（特别是Xenium 5K）因其更高的标记基因检测灵敏度和特异性而更具优势。对于侧重于组织区域水平模式的空间分析，sST平台因其更广的基因覆盖而更适合通路水平富集分析。对于涉及宿主-微生物相互作用的研究，Stereo-seq v1.3因其基于poly(A)的 unbiased捕获方式而具有独特优势。

研究人员还开发了用户友好的网络服务器SPATCH，提供数据可视化、探索和下载功能，为空间转录组建模、方法创新和生物学发现提供了宝贵资源。这一综合性基准测试研究不仅为研究人员在选择空间转录组平台时提供了科学依据，也为该技术的进一步发展和优化奠定了重要基础。