通过盐度和植物激素诱导的两阶段培养方法，在水培废液中提高富含高价值生物产物的螺旋藻生物量的生产

《Results in Engineering》：Enhancing the Production of High-Value Bioproduct-Enriched Spirulina Biomass Through Salinity and Phytohormone-Stimulated Two-Stage Cultivation in Hydroponic Effluent

螺旋藻两阶段培养优化生物质及代谢物生产并实现废水处理与CO?固定。通过盐度（0-3.5%）、水杨酸（0-200 μM）和生长调节剂（0-3 mg/L IAA）组合调控，2%盐度+100 μM SA+0.2 mg/L IAA使干重提高132%，叶绿素a达4.41 g/100g（+261%），脂质含量17.22 g/100g（+50.8%），且符合食品级纯度标准（1.45）。系统实现85%以上氮、磷去除率，CO?固定效率762.5 mg/L/天，兼具能源（ biodiesel达国际标准）、营养（PUFA丰富）和环保价值，推动循环生物经济发展。

　　本研究探讨了在蓝光条件下，使用水培废液作为低成本培养基，通过两阶段培养系统提高螺旋藻BSF的生物量和藻蓝蛋白及脂质积累的效果。与单一阶段培养相比，该系统在10天内展现出更高的生物量、藻蓝蛋白和脂质产量。研究结果表明，结合2%盐度、100微摩尔的水杨酸（SA）和0.2毫克/升的生长素（IAA）的综合处理显著提升了生物量（4.53克/升）132%，藻蓝蛋白（4.41克/100克）261%，以及脂质含量（17.22克/100克）50.8%。同时，藻蓝蛋白纯度保持在1.45，符合食品级应用标准。螺旋藻BSF的脂质含有高比例的多不饱和脂肪酸（PUFA，25.33%），并满足生物柴油标准（EN 14214、ASTM D6751、TH2020）。该培养系统能够有效去除水培废液中的营养物质，固定二氧化碳达到762.5毫克/升/天，显示出废水处理和碳捕获的潜力。这项整合方法突出了将非生物胁迫与植物激素结合，将农业废水转化为高价值产品的可能性，支持可持续生物精炼和循环经济的发展。

### 研究背景

微藻和蓝藻是一类广泛存在的光合微生物，因其丰富的营养价值和多种高附加值生物产品而受到广泛关注，包括蛋白质、脂质、碳水化合物、色素和生物活性化合物。这些生物体具有快速生长、高效的光合作用和对多种环境的适应能力，使得它们成为传统作物的潜在替代品，特别是在生物质生产方面。其中，螺旋藻（现重新分类为Limnospira）因其高蛋白含量（可达70%干重）、必需氨基酸、维生素、矿物质以及具有强大抗氧化和抗炎作用的藻蓝蛋白（PC）而尤为突出。此外，螺旋藻还能积累大量脂质，包括多不饱和脂肪酸（PUFAs），这些脂质在营养补充剂和生物柴油生产中具有重要价值。

尽管螺旋藻在生物技术领域展现出巨大的潜力，但其大规模培养仍面临诸多挑战，尤其是在生产成本和特定化合物产量优化方面。传统的培养方法通常依赖于合成营养培养基，这大大增加了运营成本。因此，研究者们正在探索使用农业废水或其他工业废液作为替代营养来源，以降低成本并提高资源利用率。水培废液（HE）是水培农业过程中产生的营养丰富的废水，含有残余的大量营养物质，能够支持藻类生长，同时有助于废水处理和营养循环。然而，水培废液的成分波动和可能存在的抑制生长的化合物，使得培养条件的优化成为关键。

除了营养因素，环境因素如盐度、光照强度、温度和营养限制对微藻的代谢和生物产品合成具有重要影响。这些非生物胁迫因子可以诱导代谢变化，从而增强特定化合物的积累，通常作为适应性生存机制。例如，适度的盐度胁迫已被证实能够刺激微藻的脂质积累，通过引发氧化应激反应，将碳流重新导向脂质生物合成。然而，过高的盐度会抑制生长和产量，因此需要精确控制和优化。此外，光照质量对光合作用和色素合成具有显著影响，蓝光被发现能显著促进生物量积累和藻蓝蛋白合成。

植物生长调节物质（植物激素）作为刺激微藻生长和生物产品积累的新方法，近年来受到关注。例如，生长素（如IAA）和水杨酸（SA）作为植物中的重要信号分子，能够调控细胞分裂、伸长和分化，同时促进代谢物合成。已有研究表明，微藻具有对这些植物激素响应的受体和信号通路，表明它们在藻类培养中可能作为生物刺激剂使用。水杨酸（SA）作为一种植物防御中的酚类化合物，能够通过调节光合作用效率、增强抗氧化酶活性和改变色素与脂质的生产来影响微藻。适度的SA浓度可以促进藻蓝蛋白积累，而过高的浓度则会抑制生长并破坏代谢。虽然SA常被视为一种通用的应激信号，促进次级代谢产物的产生，但其在微藻中的具体代谢靶点仍不明确。

### 材料与方法

本研究使用了从泰国北部淡水环境中分离出的螺旋藻BSF菌株，该菌株在光学显微镜下进行了形态学鉴定。水培废液（HE）是从泰国清迈市Hao Hak Phak农场的橡 lettuce种植过程中收集的，其特征包括pH值为8.65，化学需氧量（COD）为1100毫克/升，磷酸盐（PO?3?-P）为5.1毫克/升，硝酸盐（NO??-N）为264毫克/升，铵盐（NH??-N）为11.2毫克/升。为了去除悬浮物，水培废液经过Whatman No.1滤纸过滤后，在4°C下储存至使用。

两阶段培养策略结合了优化的培养基和非生物因素。第一阶段中，螺旋藻BSF在250毫升的烧杯中培养，培养基由100%的水培废液与25%的BG-11补充组成，通过高压蒸汽灭菌（121°C，15分钟）处理，pH值为9.5。初始细胞浓度为0.29±0.01克/升，培养在蓝光（波长450-460纳米，15瓦，AC 220伏）下进行，光照强度为80微摩尔/平方米/秒，采用16:8小时的光暗周期，并以0.1升/分钟的空气流速进行通气，持续8天。第二阶段，培养继续进行2天，培养基通过非生物因素（如盐度、SA和IAA）进行调整。所有实验均使用无菌培养。

为了评估藻蓝蛋白和脂质含量，研究者采用了多种分析方法。藻蓝蛋白的提取基于Rodrigues等人的方法进行改进，通过超声波处理和冻融循环，随后离心去除细胞碎片，并利用分光光度计测量在280、615和652纳米波长下的吸光度。脂质提取则使用氯仿和甲醇的混合溶剂，按照Maneechote等人的方法进行，通过超声波处理和离心分离后，溶剂蒸发并干燥至恒定重量。脂肪酸组成分析通过将提取的脂质转化为脂肪酸甲酯（FAMEs）进行，随后使用气相色谱仪（Agilent GC 7890）分析。多不饱和脂肪酸（PUFA）的含量通过计算总脂肪酸中的比例得出。

此外，研究还评估了生物柴油的特性，包括皂化值（SV）、碘值（IV）、十六烷值（CN）、不饱和度（DU）、长链饱和因子（LCSF）、冷滤点（CFPP）、高热值（HHV）、云点（CP）、运动粘度（ν）和密度（ρ）。同时，利用吸收光谱分析方法评估了藻蓝蛋白的纯度。为了评估CO?的固定率，研究者使用了基于生物量、碳含量和分子量的计算公式。

### 研究结果与讨论

在两阶段培养系统中，螺旋藻BSF的生物量在8天后达到1.870±0.099克/升，与之前的研究结果一致。在第二阶段，不同盐度对生物量和代谢产物的影响被评估。结果表明，低至中等盐度（0-2%）能够促进生物量和藻蓝蛋白的积累，而超过2%的盐度则显著抑制生长。2%盐度下的生物量达到2.37±0.01克/升，是对照组（0%盐度）的1.21倍。然而，随着盐度的增加，藻蓝蛋白和脂质的含量也呈现出先增加后减少的趋势。2.5%盐度下的脂质含量达到16.441±0.319克/100克，比对照组高1.44倍。这表明盐度胁迫能够诱导氧化应激，从而促进脂质生物合成。然而，过高的盐度会导致细胞生长受阻，降低代谢产物的合成效率。

SA的浓度对螺旋藻BSF的生长和代谢产物合成也产生了显著影响。在第二阶段，SA浓度为25、50、100和200微摩尔时，生物量和藻蓝蛋白含量均有所提高。100微摩尔SA在2%盐度下表现出最佳效果，生物量达到3.73±0.04克/升，藻蓝蛋白含量达到3.93±0.01克/100克。然而，当SA浓度增加到200微摩尔时，生物量略有下降，表明存在一个最佳浓度阈值。这表明SA能够通过调节ROS信号通路和相关酶活性，促进藻蓝蛋白和脂质的合成，但过量可能对细胞产生毒性。

IAA的添加进一步优化了螺旋藻BSF的生长和代谢产物积累。在第二阶段，不同浓度的IAA（0、0.1、0.2、0.5、1、2、3毫克/升）对生物量和藻蓝蛋白含量的影响被评估。结果表明，0.2毫克/升IAA显著提高了生物量（4.53±0.04克/升）和藻蓝蛋白含量（4.408±0.02克/100克），分别比对照组提高了132%和261%。脂质含量在1.0毫克/升IAA下达到峰值（17.221±0.064克/100克），但随着IAA浓度的增加，脂质含量开始下降。这表明IAA能够通过调节红ox环境和关键酶活性，促进脂质合成，但过量可能影响细胞代谢。

此外，研究还评估了螺旋藻BSF培养后所得脂质的营养指标。这些指标包括多不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比例（PUFA/SFA）、动脉粥样硬化指数（AI）、血栓形成指数（TI）、降胆固醇与升胆固醇脂肪酸的比例（h/H）、健康促进指数（HPI）和不饱和度指数（UI）。螺旋藻BSF的PUFA/SFA比值为0.339，处于自然来源的广泛范围内（0.02-4.94），表明其富含PUFAs，这对心血管健康具有积极影响。AI和TI分别为1.509和3.751，均处于自然来源的范围内，表明其具有较低的动脉粥样硬化和血栓形成风险。h/H比值为0.466，处于典型范围（0.41-15.0），表明其对胆固醇管理具有一定的优势。HPI和UI分别为0.665和66.769，表明其具有一定的健康促进潜力。

在生物柴油应用方面，螺旋藻BSF的脂质表现出良好的特性，包括较高的十六烷值（CN，58.43），合适的碘值（IV，61.44克/100克），良好的氧化稳定性（OS，7.85小时）和高热值（HHV，39.89兆焦耳/千克）。这些指标均符合国际生物柴油标准，表明螺旋藻BSF的脂质具有作为生物柴油原料的潜力。尽管在皂化值和密度方面略有偏差，但整体的燃料特性表明其作为可再生和环保的生物柴油原料是可行的。

在废水处理方面，螺旋藻BSF能够有效去除水培废液中的污染物，达到76.00%的COD去除率、89.38%的硝酸盐去除率、93.73%的氨氮去除率和85.30%的磷酸盐去除率。这些结果表明，该菌株在废水处理方面具有显著优势，能够将废水中的营养物质转化为高价值的藻类生物质。这与Salazar等人的研究结果一致，他们发现直接在未稀释的水培废液中培养的蓝藻能有效去除磷酸盐和硝酸盐。

CO?的固定率是评估藻类在环境修复中的另一个关键指标。本研究中，螺旋藻BSF在优化的非生物胁迫条件下，CO?固定率达到762.50毫克/升/天，显示出其高效的碳捕获能力。与其他研究相比，该固定率处于较高水平，表明螺旋藻BSF在减少工业排放和促进碳循环方面具有重要潜力。

### 结论

本研究提出了一种创新的两阶段培养策略，通过结合适度的盐度胁迫和特定植物激素的补充，显著提高了螺旋藻BSF的生物量、藻蓝蛋白含量和脂质积累。同时，该系统能够有效去除水培废液中的污染物并固定大量CO?，展示了其在废水处理和碳捕获方面的潜力。尽管研究中存在一些限制，如废水成分的变异性、规模化可行性以及长期操作验证的必要性，但这些发现为将农业废水转化为高价值生物质提供了新的思路，支持可持续生物精炼和循环经济的发展。未来的研究应进一步探索不同废水条件下的系统性能，进行技术经济和生命周期评估，以验证其在工业应用中的可行性，并优化下游处理以提高高价值生物产品的回收效率。