基于侧流层析生物传感器辅助环介导等温扩增技术实现非洲猪瘟病毒的超快速、高灵敏检测

《Talanta Open》：Lateral flow biosensor-assisted loop-mediated isothermal amplification assay for ultrafast, sensitive detection of African swine fever virus

本研究针对非洲猪瘟病毒(ASFV)缺乏快速现场检测方法的难题，开发了一种结合环介导等温扩增(LAMP)与纳米颗粒侧流层析生物传感器(LFB)的新型检测技术(ASFV-LAMP-LFB)。该技术可在35分钟内完成检测，灵敏度达0.04 fg/μL，对模拟样本的敏感性和特异性均为100%，为基层单位提供了一种高效精准的ASFV检测方案。

　　

非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）引起的一种急性、高度致死性传染病，自首次发现以来已对全球养猪业造成巨大经济损失。这种病毒可通过直接接触、间接接触以及软蜱吸血等多种途径传播，感染猪只会出现高热、虚弱、血便等临床症状，发病率和死亡率可达100%。更严峻的是，目前尚无商业化疫苗可供使用，这使得快速准确的检测技术成为防控疫情的关键屏障。

传统ASFV检测方法包括病毒分离、抗原检测和PCR核酸检测。虽然病毒分离被视为"金标准"，但操作耗时且需在生物安全三级（P3）及以上实验室进行，难以满足现场应急检测需求。PCR技术虽具有高灵敏度，但依赖精密仪器和专业操作人员，在资源有限的基层单位推广应用受限。这些技术瓶颈促使研究人员探索更快速、简便且适合现场使用的检测方案。

在此背景下，环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）技术因其操作简单、快速灵敏等特点引起关注。该技术可在恒定温度下完成核酸扩增，无需复杂的热循环仪器，特别适合现场检测。然而，传统LAMP检测结果通常通过染料显色或琼脂糖凝胶电泳判读，容易受到非特异性扩增干扰，导致结果误判。为解决这一问题，研究人员尝试将LAMP与纳米颗粒侧流层析生物传感器（Lateral flow biosensor, LFB）相结合，通过免疫层析原理实现扩增产物的特异性识别，提高检测准确性。

发表在《Talanta Open》上的这项研究创新性地开发了ASFV-LAMP-LFB检测技术，靶向ASFV高度保守的B646L基因（编码衣壳蛋白p72）。研究人员通过优化引物设计、反应温度和时间的参数，建立了一套完整的检测体系。关键技术方法包括：针对B646L基因设计特异性LAMP引物（含FAM和生物素标记）、优化63°C等温扩增条件、使用纳米颗粒侧流层析试纸条进行结果判读。模拟临床样本来自贵州省动物疾病预防控制中心提供的猪血样本，通过添加ASFV甘油储备液制备阳性模拟样本。

3.1. ASFV-LAMP-LFB检测原理

研究团队首先通过生物信息学分析设计了四组LAMP引物，通过实时浊度法筛选出扩增效率最高的第二组引物。该检测系统的核心创新在于对引物进行双重标记：在内部引物FIP的5'端修饰6-羧基荧光素（FAM），在环状引物LF的5'端修饰生物素。扩增反应在63°C下进行30分钟，产生大量同时携带FAM和生物素标记的DNA产物。随后，将1μL扩增产物滴加至LFB试纸条上，通过免疫层析原理实现可视化检测：FAM标记被试纸条检测线（TL）上的抗FAM抗体捕获，生物素标记与链霉亲和素-金纳米颗粒（SA-GNPs）结合，在5分钟内呈现两条红色条带表明阳性结果。整个检测流程可在35分钟内完成，大幅缩短了检测时间。

3.2. ASFV-LAMP-LFB反应条件优化

通过系统优化，研究人员确定了最佳反应条件。温度梯度实验显示，63°C时扩增效率最高，反应强度显著优于其他温度。时间优化实验表明，30分钟扩增即可达到稳定检测效果，此时0.04 fg/μL浓度的核酸样本可在LFB上产生清晰条带，且孔雀石绿（MG）显色效果与50分钟时相当。这一优化平衡了检测速度与灵敏度，使该方法更适合现场快速检测需求。

3.3. ASFV-LAMP-LFB性能评估

灵敏度实验结果显示，该方法对ASFV核酸的检测限达到0.04 fg/μL，即使在极低浓度下也能通过实时浊度分析、MG显色和LFB检测获得一致阳性信号。特异性评估中，该方法对伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、O型口蹄疫病毒（FMDV-O）和A型口蹄疫病毒（FMDV-A）等常见猪病原体均无交叉反应，特异性为100%。这些数据证明该方法具有优异的检测性能。

3.4. 模拟样本中ASFV的检测

在模拟临床样本验证中，研究人员制备了60份模拟血样（48份阳性，12份阴性）。ASFV-LAMP-LFB方法检测结果显示，所有阳性样本均呈阳性，所有阴性样本均呈阴性，敏感性和特异性均为100%。相比之下，传统PCR方法仅检出43份阳性样本，敏感性为89.6%。这一结果凸显了ASFV-LAMP-LFB在临床样本检测中的优势，特别是在复杂样本基质中仍保持高灵敏度。

本研究建立的ASFV-LAMP-LFB检测技术突破了传统方法的局限性，将检测时间缩短至35分钟，灵敏度达到0.04 fg/μL，且操作简单、结果判读直观。该方法不依赖昂贵仪器设备，适合在屠宰场、养殖场等基层单位推广应用，为ASF疫情防控提供了强有力的技术支撑。值得注意的是，虽然研究中使用的是模拟样本而非真实临床样本，但实验结果已充分证明该技术的可靠性。未来研究可进一步验证其在真实临床样本中的检测效能，推动该技术向实际应用转化。

该技术的成功开发不仅为ASFV检测提供了新方案，也为其他传染病病原体的现场快速检测提供了技术借鉴。通过LAMP与LFB的巧妙结合，实现了分子检测技术的简化和优化，展现了等温扩增技术与免疫层析技术融合应用的广阔前景。随着进一步优化和验证，这种检测模式有望在传染病防控、食品安全监测等领域发挥重要作用。