通过光学捕获技术利用蛋白质浓度来解析淀粉样纤维的形成过程

《JACS Au》：Deciphering Amyloid Fibril Formation through Protein Concentration by Optical Trapping

淀粉样纤维形成过程中，通过光学捕获技术实时观测到铁蛋白（Fer8）在不同pH（pD）条件下的浓度动态及纤维形成机制。研究发现，中性pD 8.4时 Fer8保持稳定24聚体结构，捕获效率高但抑制纤维形成；酸性条件（pD 1.5-3.0）下 Fer8解聚为二聚体，导致浓度快速积累（临界浓度0.53-0.63 mM），并通过分子排列促进纤维核化与延伸，其中pD 1.5时纤维形成最快。该技术揭示了pH依赖的蛋白结构稳定性与纤维形成动力学关联，为阿尔茨海默等疾病研究提供新工具。

　　本研究通过结合光镊技术与时间延时透射和荧光成像，成功实现了对蛋白质浓度动态变化的精准实时观察，特别是在铁蛋白（Fer8）形成淀粉样纤维的过程。实验中，Fer8在激光聚焦点处迅速形成凝聚体，且在不同pD（酸碱度）条件下，凝聚体的直径增长至约1.2微米，这一现象表明光镊技术能够有效调控Fer8的浓度。研究还发现，在pD 8.4（稳定24-聚体）条件下，初始的光镊捕获效率更高，而在酸性条件下（pD 1.5和2.0；亚基二聚体）则有所下降。然而，酸性溶液中出现了显著的第二阶段浓度增加，这在pD 8.4条件下并未观察到。这一现象可能与Fer8在较低pD下发生结构变化有关，从而促进了淀粉样纤维的形成。

研究进一步指出，在pD 3.0条件下，尽管存在淀粉样的形成证据（如ThT荧光和透射电子显微镜观察），但并未出现第二阶段的浓度增加，这可能是因为Fer8在该pD下的结构稳定性更高，导致其延伸速率较慢。通过定量分析Fer8亚基的浓度变化，研究发现所有条件下的淀粉样纤维形成都存在一个临界浓度，约为0.53–0.63 mM，这一浓度值在pD 1.5–3.0范围内保持一致。这表明，淀粉样纤维的形成并不完全依赖于初始的pD值，而是受到局部蛋白质密度的影响。这一发现为理解淀粉样纤维形成过程中的关键阶段提供了新的视角。

光镊技术作为一项利用聚焦激光束对纳米和微米尺度颗粒进行非接触捕获和操控的强效方法，已在淀粉样纤维形成研究中展现出独特优势。其基本原理是通过光子动量向目标物体的转移，产生光学力。在纳米尺度的靶标（如本研究中的Fer8）中，瑞利散射机制是主要的“梯度力”，该力与激光强度的空间梯度及靶标的极化率相关，能够将颗粒拉向激光焦点。与此同时，“散射力”则由散射光子的动量转移引起，其方向与光传播方向一致，但在小尺寸靶标中影响较小。光镊技术能够实现三维捕获，并对溶液中的微靶进行精准控制，尤其在淀粉样研究中，它允许对蛋白质在激光焦点处的局部浓度变化进行检测，从而支持原位光谱测量。这种对时空动态的精确控制和实时观察，为生物物理、药物发现等领域提供了重要的研究工具。

本研究通过光镊技术对Fer8在不同酸性条件下的淀粉样纤维形成过程进行了深入探讨。Fer8是一种由24个亚基组成的球形笼状蛋白，具有基本的4-螺旋束结构。在酸性条件下，Fer8会解离为亚基二聚体，而这种结构变化可能为其形成淀粉样纤维提供了必要的条件。研究发现，在pD 8.4条件下，Fer8维持其稳定的24-聚体结构，导致其在激光聚焦点处的捕获效率较高，从而在短时间内形成凝聚体。然而，由于结构的稳定性，淀粉样纤维的形成受到抑制。相反，在酸性条件下（pD 1.5、2.0和3.0），Fer8解离为亚基二聚体，这种结构变化可能促进了淀粉样纤维的形成。实验中观察到，在pD 1.5和2.0条件下，淀粉样纤维的形成表现出明显的第二阶段浓度增加，而在pD 3.0条件下则未见此现象。这表明，淀粉样纤维的形成不仅与pD值有关，还与蛋白质的浓度变化密切相关。

通过比较不同pD条件下的蛋白质浓度变化和淀粉样纤维形成时间，研究进一步揭示了pD值对淀粉样纤维形成过程的调控作用。例如，在pD 1.5条件下，淀粉样纤维的形成时间较早，而在pD 3.0条件下则较晚。这一现象可能与Fer8在不同pD下的结构稳定性有关，较低的pD值导致Fer8的结构稳定性下降，从而促进了其解离和淀粉样纤维的形成。研究还发现，尽管在pD 3.0条件下Fer8的浓度变化较为缓慢，但ThT荧光仍能明确检测到淀粉样纤维的形成，这表明在该pD下，虽然淀粉样纤维的形成时间较晚，但其形成过程仍然存在。这一结果进一步支持了淀粉样纤维的形成不仅依赖于初始的pD值，还受到局部蛋白质浓度的影响。

此外，研究还探讨了光镊技术在淀粉样纤维形成中的作用机制。光镊技术不仅能通过梯度力实现对蛋白质的浓度调控，还可能通过激光的极化特性促进蛋白质分子的特定排列。这种排列可能为淀粉样纤维的形成提供了必要的结构条件。研究中提到，Fer8在酸性条件下的解离为亚基二聚体，这种结构变化可能使其更容易发生构象变化，从而进入淀粉样纤维形成所需的聚集状态。通过结合时间延时透射和荧光成像，研究揭示了淀粉样纤维形成过程中的不同阶段，包括核化和延伸。这些发现不仅加深了对淀粉样纤维形成机制的理解，还为相关疾病的治疗策略提供了新的思路。

本研究的另一个重要发现是，尽管在pD 3.0条件下Fer8的浓度变化较为缓慢，但ThT荧光仍能检测到淀粉样纤维的形成。这表明，淀粉样纤维的形成并不完全依赖于局部蛋白质浓度的快速增加，而是与蛋白质的解离和结构变化密切相关。研究还指出，光镊技术在淀粉样纤维形成过程中可能起到了关键作用，不仅通过浓度调控促进纤维的形成，还可能通过分子排列加速这一过程。这一发现为理解淀粉样纤维形成中的复杂机制提供了新的视角，同时也为开发新型的生物材料和药物提供了理论依据。

研究还探讨了光镊技术对局部温度的影响。实验中估计，激光聚焦点处的局部温度升高约为2.1 K，这一温度变化对淀粉样纤维的形成影响较小，表明观察到的淀粉样纤维形成动态主要由光镊诱导的局部蛋白质浓度和pD依赖的蛋白质构象变化所驱动。这一发现进一步支持了光镊技术在淀粉样纤维形成研究中的重要性。通过结合多种实验方法，包括时间延时透射、荧光成像和透射电子显微镜，研究揭示了淀粉样纤维形成过程中的关键阶段和机制，为相关领域的研究提供了新的思路和方法。这些结果不仅加深了对淀粉样纤维形成过程的理解，还为开发新的生物材料和治疗策略提供了理论支持。