利用全基因组测序和计算机模拟的多位点可变数目串联重复序列分析方法，显著提高了对艰难梭菌传播途径的识别能力

《Microbiology Spectrum》：Enhanced discrimination of Clostridioides difficile transmission using whole-genome sequencing and in silico multi-locus variable number tandem repeat analysis

艰难梭菌全基因组测序（WGS）常因遗传相似度过高难以识别流行病学关联，本研究结合短读WGS和长读测序技术进行MLVA分析，发现STRD值与单位内流行病学联系显著相关（OR:0.45）。MLVA可补充WGS不足，提升医院内传播追踪精度。

　　本研究探讨了通过全基因组测序（WGS）识别出的、具有单核苷酸多态性（SNP）差异的艰难梭菌（Clostridioides difficile）菌株，是否可以通过一种名为“虚拟多位点可变串联重复分析”（in silico MLVA）的方法进一步提高其遗传相关性的判断精度。这项研究在一所大型成人三级医院——UPMC Presbyterian Hospital中进行，收集了2016年11月至2019年11月期间的666个艰难梭菌分离株，并使用短读长WGS对其中具有≤2个SNP差异的菌株进行了分类，随后利用长读长测序技术（如Nanopore MinION）对这些菌株进行深入分析，以确定它们是否具有真实的医院传播关系。

艰难梭菌是一种在医疗机构中常见的病原体，它引起的感染往往难以追溯其传播路径。尽管WGS已经成为细菌遗传关系分析的标准工具，但在某些情况下，尤其是当菌株之间SNP差异较小时，这种方法可能不足以区分是否具有实际的医院传播关系。这是因为艰难梭菌的基因组突变速度相对较慢，且其孢子形式使得基因复制受到限制，因此SNP差异的范围可能不足以准确反映其传播模式。为了解决这一问题，研究者引入了MLVA技术，这是一种基于细菌基因组中高度可变的串联重复区域的分析方法，能够提供更精细的遗传关系信息。

在研究中，首先通过短读长WGS（使用Illumina平台）对所有样本进行分析，并将具有≤2个SNP差异的菌株划分为一个遗传簇。接着，这些菌株被进一步用长读长测序技术进行分析，以精确测定MLVA位点的重复数目。最终，研究者计算了这些菌株之间的“总串联重复差异”（summed tandem-repeat difference, STRD），即在所有七个MLVA位点上重复数目差异的总和。通过比较这些STRD值与已知的医院传播关系，研究者发现，STRD值越低，菌株之间存在医院传播关系的可能性越高。

研究结果显示，在105对具有0至2个SNP差异的菌株中，79%的STRD值为0至5，10.5%的STRD值为6至10，10.5%的STRD值为11至20。这些结果表明，虽然SNP差异较小，但STRD值的变化范围较大，说明在某些情况下，即使基因组相似度较高，菌株之间的传播关系仍可能不明确。进一步的统计分析表明，STRD值与是否存在医院传播关系之间存在显著相关性，具体而言，STRD值较低的菌株对更可能具有医院传播关系。这种相关性在单位（unit）层面的传播关系中尤为明显，其比值比（odds ratio）为0.45，置信区间为0.29至0.70，说明每增加一个STRD单位，菌株之间存在单位层面传播关系的可能性会下降55%。

这些发现强调了MLVA在艰难梭菌遗传相关性分析中的重要性。尽管WGS已经成为主流技术，但在某些情况下，尤其是当菌株之间的SNP差异较小时，MLVA能够提供额外的分辨率，帮助识别真正的传播事件。通过将WGS与MLVA相结合，医院可以更精确地追踪感染源，提高对潜在爆发的识别能力，从而优化感染控制措施，减少病原体的传播。

此外，研究还比较了三种不同的测序方法对MLVA位点分辨率的影响。结果显示，使用长读长测序（ONT）结合短读长测序（Illumina）进行优化组装的方法，相较于仅使用短读长测序或混合测序，能够更准确地识别MLVA位点的重复数目。这种方法不仅提高了数据的可靠性，还降低了对传统Sanger测序的依赖，使得MLVA分析在临床环境中更加高效和经济。

在实际应用中，医院的感染控制团队通常会结合电子健康记录（EHR）中的数据，如患者就诊信息、病房分配情况以及医护人员的活动轨迹，来辅助判断感染传播的路径。然而，这些信息有时并不能完全揭示传播关系，特别是在多患者共享同一病房或同一医疗程序的情况下。因此，引入MLVA分析作为补充手段，能够有效区分那些在基因组上看似相关但实际并无传播关系的菌株，从而避免资源浪费在假阳性传播事件上。

研究的局限性也值得注意。首先，未对无症状携带者进行采样，这些携带者可能是潜在的传播源，但未被纳入分析。其次，虽然研究团队对传播路径进行了详尽的调查，但可能存在一些传播事件未被识别，尤其是在电子健康记录数据不完整或信息不明确的情况下。此外，STRD作为串联重复差异的总和，虽然能提供整体的遗传距离信息，但未能考虑单个位点上较大的差异是否可能代表一次突变事件。尽管如此，研究者指出，在之前的研究中，环境和连续患者分离株的分析表明，大多数突变差异通常局限于单个重复的变化，因此STRD作为一个整体指标仍然具有较高的实用性。

总的来说，这项研究为医院感染控制提供了新的工具和方法。通过结合WGS和MLVA分析，可以更精准地识别艰难梭菌的传播事件，特别是在基因组相似度较高但缺乏明确流行病学联系的情况下。这种多技术融合的策略不仅提高了流行病学调查的准确性，还为未来的感染监测和控制提供了重要的参考依据。随着测序技术的不断进步，虚拟MLVA分析将成为医院环境中追踪病原体传播的有力手段，帮助感染控制团队更有效地制定干预措施，保护患者免受感染。