通过基于DEPArray的排序方法，从经福尔马林固定、石蜡包埋的组织中分离出纯癌细胞和间质细胞群，随后进行浅层全基因组测序，以识别可进行干预的治疗靶点

《The Journal of Pathology》：Identification of actionable targets using DEPArray-based sorting of pure carcinoma and stromal populations from formalin-fixed paraffin-embedded tissues followed by shallow whole-genome sequencing

FFPE样本通过DEPArray NxT系统分离纯肿瘤细胞和基质细胞，结合shallow WGS和靶向基因 panel分析，成功检测到sCNA和突变，发现PIK3CA、ERBB2、FGFR1/2、CDK6、CCNE1、KRAS扩增及RB、BRCA1/2缺失等可行动物靶点，指导临床治疗选择。

　　本研究围绕如何从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中提取高质量的基因组数据，探索了一种创新的方法，以应对传统技术在处理这类样本时面临的挑战。FFPE组织是临床病理学研究中极为重要的资源，广泛用于癌症诊断和回顾性分子分析。然而，由于长期的化学固定和储存，这些组织中的DNA往往降解严重，提取的DNA量也较低，这使得基于FFPE组织的基因组研究面临诸多困难。例如，DNA的片段化、化学修饰以及细胞异质性等因素，均可能影响基因组数据的准确性和可靠性。此外，由于FFPE组织中非癌细胞成分（如间质细胞）的存在，可能会稀释癌细胞的基因组信号，从而影响对癌基因拷贝数变异（sCNA）和突变的检测。为了解决这些问题，研究团队采用了一种基于微芯片的数字细胞分选系统——DEPArray? NxT系统，该系统能够精确地识别、表征并分离出单个细胞或荧光标记的稀有细胞，从而实现对FFPE样本中纯癌细胞和间质细胞的分离。通过这种方法，研究人员能够获得更清晰的基因组信号，进而进行更精准的分子分析。

在本研究中，团队从12个FFPE组织样本中分离出纯癌细胞和间质细胞，包括来自9名乳腺癌患者（包括原发性和转移性肿瘤）和3名卵巢高分化浆液性癌（HGSC）患者的样本。随后，这些细胞样本被用于浅层全基因组测序（sWGS）和靶向基因面板分析，以评估其基因组特征。结果显示，70%的样本（共10个）能够生成高质量的基因组数据，这些数据不仅能够检测到所有癌细胞中的sCNA，还能在部分样本中检测到体细胞突变。这一成果表明，DEPArray? NxT系统在处理低肿瘤细胞含量或高龄样本时，仍然具有较高的可靠性。

值得注意的是，对于某些样本而言，即使肿瘤细胞含量较低（如10%），DEPArray? NxT系统依然能够成功分离出癌细胞并进行基因组分析。这为那些无法通过传统方法获得足够肿瘤细胞的样本提供了新的解决方案。例如，在样本11和12中，来自同一患者的原发性乳腺癌组织和淋巴结样本，其肿瘤细胞含量分别为10%和15%，但通过DEPArray?技术，研究人员仍然成功检测到了PIK3CA和ESR1等关键基因的拷贝数变化。这些变化可能与患者对内分泌治疗的反应相关，从而为临床决策提供重要依据。此外，研究团队还发现，某些样本中存在FGFR1、ERBB2、CDK6等基因的扩增，以及RB、BRCA1/2等基因的缺失，这些基因的异常可能与肿瘤的发展和治疗反应密切相关。因此，通过DEPArray?分离的纯细胞样本，不仅提高了基因组数据的准确性，也为临床治疗方案的选择提供了更多可能。

在分析过程中，研究人员还发现，DEPArray?技术能够有效减少非癌细胞成分对基因组信号的干扰。传统方法中，由于样本的异质性，非癌细胞的基因组信号可能会掩盖癌细胞的特征，导致检测结果不准确。而DEPArray?通过精确的细胞分选，能够将癌细胞与间质细胞分离开来，从而获得更纯净的基因组数据。这种分离方法在处理低肿瘤细胞含量的样本时尤为重要，因为这些样本在传统分析中往往难以获得足够的信号。此外，研究团队还对比了DEPArray?技术与传统的FFPE组织芯提取方法。结果显示，DEPArray?技术在低肿瘤细胞含量样本中表现更为优异，尤其是在检测基因拷贝数变化和突变方面，其结果更加准确和可靠。例如，在样本11和12的分析中，DEPArray?技术检测到的基因拷贝数变化比传统方法更为显著，这表明其在提升数据质量方面具有显著优势。

研究团队还对基因拷贝数变化的临床意义进行了深入探讨。例如，PIK3CA和ERBB2的扩增可能与特定的治疗方案相关，如PI3K/AKT抑制剂和HER2靶向治疗。RB基因的缺失或CDK6的扩增则可能影响患者对CDK4/6抑制剂的敏感性。此外，某些基因如BRCA1/2的缺失可能意味着患者对PARP抑制剂的潜在敏感性，而ESR1的缺失可能与内分泌治疗的耐药性相关。这些发现不仅有助于理解肿瘤的分子机制，也为个体化治疗提供了新的思路。例如，针对某些患者，医生可以根据检测到的基因拷贝数变化，选择更合适的靶向药物，从而提高治疗效果并减少不必要的副作用。

在实验过程中，研究团队采用了多种方法来确保数据的准确性和可靠性。首先，他们使用了DEPArray? FFPE样本制备试剂盒对FFPE组织进行解离和染色，并利用DEPArray? FFPE质量控制试剂盒对细胞悬液进行评估。这一过程确保了细胞的完整性，并为后续的基因组分析提供了高质量的输入。其次，在基因组分析阶段，研究人员采用了不同的方法，包括浅层全基因组测序和靶向基因面板分析。这些方法能够分别检测拷贝数变化和突变，从而全面覆盖基因组的多个层面。此外，研究团队还利用了不同的生物信息学工具，如ichorCNA和MSBiosuite，对数据进行了处理和分析。这些工具不仅能够计算肿瘤细胞比例（TFx）和拷贝数变化，还能帮助研究人员识别潜在的治疗靶点。

研究还探讨了FFPE组织存储时间对基因组数据质量的影响。尽管某些研究表明，FFPE组织的存储时间可能会影响DNA的完整性，但本研究发现，即使在存储时间较长（长达10年）的情况下，DEPArray?技术依然能够生成高质量的基因组数据。这一发现对于临床研究具有重要意义，因为许多患者在疾病复发后，其原发性肿瘤样本可能已存储多年，无法通过传统方法获得足够的信息。因此，DEPArray?技术为这些样本的分子分析提供了新的可能性。此外，研究团队还发现，DEPArray?技术能够有效减少样本的异质性，提高基因组分析的准确性。例如，在样本3中，研究人员检测到了FGFR1和ERBB2的扩增，而这些扩增在传统方法中可能被忽略。这表明，DEPArray?技术能够发现一些在常规分析中难以识别的基因变化，从而为患者提供更全面的治疗方案。

本研究的另一个重要发现是，DEPArray?技术能够显著提高低肿瘤细胞含量样本的分析效率。传统的FFPE组织芯提取方法虽然能够富集肿瘤细胞，但其依赖于病理学家的判断，且难以保证细胞的纯度。相比之下，DEPArray?技术能够自动识别和分离肿瘤细胞，从而避免了人为误差。此外，该技术能够在较小的样本中分离出足够的细胞，使得基因组分析更加可行。例如，在样本11和12中，研究人员仅需分离少量的细胞即可获得可靠的基因组数据，这为处理稀缺样本提供了新的思路。这种技术的应用，使得研究人员能够更有效地利用有限的样本资源，进行更深入的分子研究。

在实际应用中，DEPArray?技术不仅适用于乳腺癌和卵巢癌，还可能适用于其他类型的癌症。例如，该技术已被用于分离 Hodgkin 和 Reed–Sternberg 细胞、B 细胞、胶质母细胞瘤细胞以及眼色素层炎细胞等，这些细胞的分离有助于研究不同癌症类型的分子特征。此外，该技术还能够处理冷冻和新鲜组织样本，这进一步拓宽了其应用范围。对于那些肿瘤细胞含量较低的样本，DEPArray?技术能够提供比传统方法更准确的数据，从而为临床决策提供更可靠的依据。

本研究还强调了基因组分析在癌症治疗中的重要性。许多癌症类型，如乳腺癌和卵巢癌，其发展和预后可能受到基因拷贝数变化的影响。因此，准确检测这些变化对于制定个体化治疗方案至关重要。通过DEPArray?技术，研究人员能够识别出与疾病进展和治疗反应相关的基因变化，如FGFR1、ERBB2、PIK3CA等基因的扩增，以及RB、BRCA1/2等基因的缺失。这些发现不仅有助于理解肿瘤的生物学行为，还可能为未来的治疗策略提供新的方向。例如，某些患者可能因为特定的基因拷贝数变化而受益于特定的靶向治疗，如PI3K/AKT抑制剂、HER2靶向治疗或PARP抑制剂。

然而，本研究也指出了其局限性。首先，样本数量较小，可能限制了研究的广泛适用性。其次，研究中涉及的组织类型和癌症亚型较为有限，未来需要进一步扩大样本范围，以验证该技术的普适性。此外，尽管DEPArray?技术能够提高数据质量，但其仍需依赖高质量的细胞分离和后续的测序流程。因此，在实际应用中，研究人员需要综合考虑多种因素，如细胞数量、DNA完整性以及测序平台的选择，以确保最终结果的可靠性。

总体而言，本研究展示了一种利用DEPArray? NxT系统进行FFPE组织细胞分选的新方法，为癌症的分子分析提供了重要的技术支持。该技术不仅能够克服传统方法在处理低肿瘤细胞含量样本时的局限性，还能够提高基因组数据的准确性和可靠性。通过这种方式，研究人员能够更深入地了解肿瘤的分子特征，从而为个体化治疗提供更科学的依据。未来，随着该技术的进一步优化和推广，它有望在临床研究和治疗决策中发挥更大的作用。