基于混合金属纳米粒子多色显色增强的多重侧向流免疫分析技术用于上皮间质转化关键蛋白同步检测

《Sensors and Actuators Reports》：Colorimetric enhancement of mixed metal nanoparticle based multicolor and multiplex lateral flow immunoassay for analysis of two epithelial-mesenchymal transition-related proteins

本研究针对上皮间质转化（EMT）过程中E-钙黏蛋白（E-cad）和N-钙黏蛋白（N-cad）同步检测的临床需求，创新性地开发了基于多色金属纳米粒子混合效应的多重侧向流免疫分析（mLFIA）平台。通过将品红色金纳米粒子（M-AuNPs）分别与黄色核壳金@银纳米粒子（Y-Au@Ag NPs）、青色空心金银纳米粒子（C-hollow Au/Ag NPs）物理混合，成功构建了显色增强的红色和海军蓝色信号探针，实现了对E-cad和N-cad的同时、特异、高灵敏定量检测，检测限分别达到24.7 pg mL-1和34.7 pg mL-1。该技术为肿瘤EMT过程的早期筛查和转移风险评估提供了重要技术支持。

　　

在肿瘤转移的复杂过程中，上皮间质转化（EMT）扮演着关键角色。这一过程使得上皮细胞失去极性，获得间质特性，从而增强细胞的迁移和侵袭能力。E-钙黏蛋白（E-cad）和N-钙黏蛋白（N-cad）作为EMT过程中的两个核心生物标志物，它们的动态变化可以有效反映肿瘤的转移状态。然而，现有的检测方法如免疫组织化学、酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫荧光等，存在成本高、耗时长、依赖专业设备等局限性，难以满足临床快速、床边检测（POC）的需求。

面对这一挑战，顾耀阳等人发表在《Sensors and Actuators Reports》上的研究提出了一种创新解决方案。研究人员开发了一种基于多色金属纳米粒子混合效应的多重侧向流免疫分析（mLFIA）平台，成功实现了对E-cad和N-cad的高灵敏同步检测。

研究团队主要采用了三种关键技术方法：首先合成了具有特征颜色的三种金属纳米粒子（M-AuNPs、Y-Au@Ag NPs和C-hollow Au/Ag NPs）；然后通过物理混合筛选出最佳组合，构建显色增强的检测探针；最后建立多重侧向流免疫分析试纸条，实现对两个靶蛋白的同时检测。

材料表征确认纳米粒子性能

通过透射电子显微镜（TEM）观察显示，三种纳米粒子均具有良好的单分散性，但形态各异：M-AuNPs为规则圆形颗粒，Y-Au@Ag NPs呈立方体结构，C-hollow Au/Ag NPs则具有明显的中空结构。动态光散射（DLS）分析表明三种纳米粒子的平均尺寸分别为39.50、40.39和44.90 nm。紫外-可见光谱显示它们的局部表面等离子体共振（LSPR）吸收峰分别位于539、409和629 nm处，这为后续的颜色混合提供了基础。

混合纳米粒子显色增强效果验证

研究人员将M-AuNPs与Y-Au@Ag NPs混合得到红色纳米粒子（Red NPs），将M-AuNPs与C-hollow Au/Ag NPs混合得到海军蓝色纳米粒子（Blue NPs）。实验证明，这些混合纳米粒子在试纸条上显示出比单一纳米粒子更强的显色效果。在30、40和50 ng mL^-1的E-cad浓度下，Red NPs-LFIA在T1线上的颜色强度相比M-AuNPs-LFIA分别提高了25.92%、30.83%和14.17%。对于N-cad蛋白，Blue NPs-LFIA的颜色信号强度相比C-hollow Au/Ag NPs-LFIA增加了10.86%、6.96%和8.44%。

多重检测性能评估

该mLFIA试纸条展现出优异的双靶标检测能力。当只存在E-cad时，T1线出现明显的红色条带，T2线无信号；只存在N-cad时，T2线出现海军蓝色条带，T1线无信号；当两种蛋白同时存在时，T1和T2线同时出现清晰的红色和海军蓝色条带，证明试纸条具有高特异性且两种检测线之间无显著信号干扰。在0.047-4.69 ng mL^-1浓度范围内，E-cad和N-cad的检测呈现良好的线性关系，线性相关系数（R²）分别为0.988和0.997。

分析方法验证与比较

该方法对E-cad和N-cad的检测限（LOD）分别达到24.7 pg mL^-1和34.7 pg mL^-1，定量下限（LLOQ）分别为82.2 pg mL^-1和115.6 pg mL^-1。特异性实验表明，即使存在100倍浓度的P-钙黏蛋白（P-cad）、β-连环蛋白（β-catenin）、人血清白蛋白（HSA）和人免疫球蛋白G（IgG）等潜在干扰物质，试纸条仍能特异性识别E-cad和N-cad，显示出优异的选择性。

研究结论表明，这种基于多色金属纳米粒子混合策略的mLFIA平台成功解决了传统多重检测中信号区分度差和灵敏度低的两大难题。通过简单的物理混合方法，不仅实现了信号的颜色区分，还利用纳米粒子间的等离子体耦合效应增强了显色强度。该技术为EMT过程的监测和肿瘤转移风险评估提供了一种快速、灵敏、低成本的检测工具，在癌症早期筛查和预后监测方面具有重要应用前景。

需要注意的是，该研究目前仍处于"概念验证"阶段，在真实临床样本中的检测性能及其对复杂基质效应的抗干扰能力仍有待进一步验证。未来的研究将重点探索如何通过纳米粒子表面修饰或试纸条改进来提升其在临床样本中的适用性，并在细胞水平和大型临床队列中全面验证其检测性能。