喜马拉雅松体细胞胚胎发生技术的优化与创新：提升林木再生效率的关键突破

《Scientific Reports》：An improved and simplified somatic embryogenesis protocol in Chir pine (Pinus roxburghii)

语 本研究针对喜马拉雅松（Pinus roxburghii）体细胞胚胎发生（SE）技术效率低下的难题，通过优化合子胚胎发育阶段筛选与培养基组合，将胚胎发生诱导率提升至33%，并建立高效增殖与成熟体系。该协议首次系统描述该物种合子与体细胞胚胎发育过程，为亚洲重要松树的无性系繁殖和森林资源恢复提供技术支撑，虽生根率仍待改进，但为气候变暖背景下的林业生物经济奠定基础。

　　

森林作为国家生物经济的重要支柱，正面临全球性退化危机。喜马拉雅松（Pinus roxburghii）作为巴基斯坦生态与经济的关键树种，在气候变化时代的造林计划中扮演先锋角色。然而，其体细胞胚胎发生（Somatic Embryogenesis, SE）技术长期存在诱导率低、重复性差等瓶颈。以往研究报道的SE诱导率仅0.5%-1.0%，且成熟胚胎转化效率不足，严重制约该树种的规模化繁殖。本研究基于北美火炬松（Pinus taeda）的成熟SE协议，首次系统优化喜马拉雅松的体细胞胚胎发生体系，旨在建立高效、可重复的再生技术平台。

研究团队通过三个关键实验阶段推进工作：合子胚胎发育阶段鉴定、胚胎发生组织诱导与增殖、体细胞胚胎成熟与转化。技术核心包括：采用Cairney和Pullman的胚胎分期系统标准化合子胚胎发育阶段；使用改良LP培养基（如LP-889用于诱导，LP-1250用于增殖）并优化植物生长调节剂（如NAA、BAP、Kinetin、ABA）组合；通过L-谷氨酰胺与ABA浓度调控促进胚胎成熟。实验样本来自巴基斯坦拉合尔植物园开放授粉树的未成熟球果（2016-2018年连续采集），并在巴基斯坦与瑞典实验室协同完成跨区域验证。

合子胚胎发育动态决定SE诱导窗口

研究首次绘制喜马拉雅松合子胚胎发育时序图：6月18日采集的胚胎处于原胚阶段（具初生胚柄），6月23日出现多胚现象，6月29日进入后裂生阶段并出现单一胚胎优势。7月2日至7日为预子叶期，胚胎头部呈圆顶状；7月7日后进入早期子叶期，至7月20日子叶完全包被顶端分生组织。关键发现是，单个球果内合子胚胎发育阶段存在异步性，且SE诱导成功率与胚胎发育阶段紧密关联。

胚胎发生组织诱导效率显著提升

未成熟预子叶期合子胚胎在LP-889培养基（含11μM NAA、2.5μM BAP、2.5μM Kinetin、4μM ABA）中诱导率达33%，显著高于历史数据。胚胎组织挤出（Extrusion）在接种后数小时内即可观察，而持续增殖的胚胎发生组织（Initiation）需2-3周形成。2016-2018年间，6月29日采集的样本表现最佳，挤出率和诱导率分别达78.7%和33.34%，7月5日后诱导率急剧下降，证实合子胚胎发育窗口期仅存于6月末至7月初。

胚胎发生组织增殖特性分析

三种胚胎发生细胞系（CL-1、CL-2、CL-3）在LP-1250培养基（含2μM BAP、2μM Kinetin、5μM 2,4-D、5μM ABA）中均实现稳定增殖，CL-2表现最优，培养12天内生物量快速增长。极化未成熟体细胞胚胎在增殖阶段清晰可辨，其头部不透明而胚柄半透明，形成典型早期体细胞胚胎簇。

体细胞胚胎成熟条件优化

对比LP-1562与mLV培养基发现，LP-1562（含450 mg/L L-谷氨酰胺、20μM ABA）的胚胎产量（310胚胎/g组织）显著高于mLV（含900 mg/L L-谷氨酰胺、60μM ABA时的204胚胎/g组织）。L-谷氨酰胺浓度超过900 mg/L时胚胎产量下降，而ABA浓度升高至80μM亦抑制成熟。体细胞胚胎在成熟培养基中6-8周发育为子叶期胚胎，其发育过程经历原胚、球形胚、心形胚等典型阶段。

体细胞胚胎转化效率仍存挑战

成熟胚胎在LP-397或MS培养基（含10μM IBA）中经12周培养可实现转化，但生根率极低（LP-1562来源胚胎7%，mLV来源胚胎3%）。虽针叶发育正常，但根系发育不足导致植株存活困难，且体细胞胚胎早熟萌发（precocious germination）问题尚未解决。

本研究通过系统优化喜马拉雅松体细胞胚胎发生协议，将诱导率提升至松属物种领先水平，并首次揭示该树种合子与体细胞胚胎发育规律。尽管胚胎转化环节仍为技术瓶颈，但建立的高效诱导与成熟体系为亚洲松树遗传改良和森林恢复提供关键技术支撑。未来研究需聚焦生根机制调控与早熟萌发抑制，以推动该协议向规模化应用迈进。