新型微创生物标志物检测技术：肝穿刺与血清外泌体在威尔逊病ATP7B监测中的应用价值

《Scientific Reports》：Novel and less invasive biomarker assays to measure liver ATP7B in Wilson disease patients

本研究针对威尔逊病(WD)新型疗法开发缺乏有效生物标志物的难题，开发了基于细针穿刺(FNA)和电化学发光(ECL)免疫检测的创新方法。研究人员通过qPCR和新型免疫检测技术，首次系统比较了细针穿刺(FNA)、粗针穿刺(CNB)和血清外泌体三种样本中ATP7B mRNA和蛋白的表达水平。结果显示FNA与CNB的ATP7B mRNA检测具有显著相关性(R2=0.64)，而血清外泌体检测尚不成熟。该研究为WD基因治疗监测提供了重要的方法学基础。

　　

在遗传性罕见病研究领域，威尔逊病(Wilson disease, WD)作为一种常染色体隐性遗传病，长期以来困扰着医学界。这种由ATP7B基因突变引起的铜代谢障碍疾病，会导致铜离子在肝脏、大脑等器官异常蓄积，引发肝硬化、神经精神症状甚至死亡。尽管现有疗法包括饮食控制和终身铜螯合剂治疗，但患者常因严重副作用而难以坚持用药，肝移植成为终末期患者的唯一希望。

随着基因治疗等新型疗法的兴起，如何准确评估治疗效果成为关键挑战。传统诊断主要依赖血清铜、尿铜和血清铜蓝蛋白等间接指标，缺乏直接反映肝细胞ATP7B表达水平的监测手段。肝粗针穿刺(CNB)虽是金标准，但其侵入性高、风险大，限制了重复采样。因此，开发微创甚至无创的生物标志物检测方法迫在眉睫。

在这项发表于《Scientific Reports》的研究中，Rosanna J. Jiang等研究人员开展了一项创新性探索。他们旨在建立能够准确量化肝细胞ATP7B表达的新型检测方法，为未来WD基因治疗临床试验提供可靠的生物标志物和临床终点。

研究团队设计了一项单中心样本收集研究，共纳入27名参与者，包括21名WD患者和6名对照。通过系统比较细针穿刺(FNA)、粗针穿刺(CNB)和血清外泌体三种样本类型，研究人员开发并优化了ATP7B mRNA的定量PCR(qPCR)检测方法和ATP7B蛋白的电化学发光(ECL)免疫检测方法。

关键技术方法包括：采用超声引导下的肝细针穿刺(FNA)和粗针穿刺(CNB)采集样本；通过超速离心和亲和层析法分离血清外泌体；建立优化的RNA提取和qPCR检测流程；开发新型ECL免疫检测方法用于ATP7B蛋白定量；使用多参考基因归一化策略进行数据分析。样本来源于多伦多总医院UHN肝病科的临床患者队列。

基线特征

研究队列包含16例复合杂合变异和5例纯合变异患者，中位年龄34岁。肝活检结果显示WD组活动度分级为0-1级，纤维化分期为0-4级。所有患者均接受过铜螯合剂(90%)、锌补充剂(86%)或低铜饮食(76%)治疗。

血液样本分析

研究发现ATP7B mRNA在新鲜WD患者血清外泌体中可被检测，但在冻存血清中检测可靠性较差(Ct>35)。柱亲和法与外泌体分离方法效果相当，但血清外泌体因ATP7B表达量低和技术变异大，目前尚不适合作为可靠的定量方法。

肝组织mRNA检测

ATP7B mRNA在CNB和FNA样本中均成功检测。CNB结果显示4/5例WD患者ATP7B mRNA表达降低，与基因型预期一致：WL01(基因缺失)表达降低60%，WL05(早期终止密码子)降低70%。有趣的是，WL04(M645R突变)表达反而增加44%，可能与突变特异性效应相关。

FNA结果与CNB趋势基本一致，WL02和WL05分别显示7%和45%的表达降低，WL04增加135%。WL01和WL03结果不一致可能源于肝细胞数量变异。

FNA与CNB相关性

FNA与CNB的ATP7B mRNA表达水平呈现显著正相关(R²=0.64，p=0.0003)，表明FNA作为微创检测方法的可行性。

蛋白检测新方法

研究人员成功开发了新型ECL免疫检测方法，线性R²>0.9，变异系数<20%。该方法在CNB样本中成功量化ATP7B蛋白，检测下限为65pg/mL，定量下限为459pg/mL。所有WD样本ATP7B蛋白水平均低于4pg/μg总蛋白，与基因型预期相符：WL01和WL05完全缺失蛋白表达，WL02和WL03分别降低72%和54%。

与铜代谢标志物相关性

CNB和FNA的ATP7B mRNA与血清铜蓝蛋白呈显著正相关(R²=0.94和0.79)，与24小时尿铜呈负相关。蛋白检测结果与铜代谢标志物无显著相关性，提示方法需进一步优化。

研究结论与意义

本研究成功建立了检测肝ATP7B mRNA和蛋白的创新方法体系。FNA作为CNB的微创替代方案显示出巨大潜力，其与CNB mRNA检测的良好相关性为临床监测提供了新思路。新型ECL免疫检测方法首次实现了WD患者肝组织ATP7B蛋白的准确量化。

这些方法的建立对WD新型治疗开发具有重要意义：首先，FNA的微创特性支持治疗过程中的重复采样，便于动态监测治疗反应；其次，直接检测肝细胞ATP7B表达为基因治疗提供了特异性生物标志物；最后，这些方法有助于理解不同ATP7B变异对表达水平的影响，为个性化治疗提供依据。

尽管血清外泌体检测目前尚不成熟，FNA样本的肝细胞含量标准化仍需完善，但本研究为WD精准医疗奠定了方法学基础。随着进一步验证和优化，这些检测方法有望成为WD基因治疗临床试验的关键评估工具，推动该领域向更精准、微创的方向发展。

值得注意的是，两种基于腺相关病毒的WD基因疗法(VTX-801和UX701)已进入临床试验阶段，本研究开发的生物标志物检测方法有望为这些创新疗法提供重要的疗效评估手段。未来研究应聚焦于大样本验证、诊断前患者纳入以及治疗前后动态监测，进一步确立这些方法在WD诊疗中的应用价值。