综述：无饲养层技术在T细胞发育和治疗中的进展

《Cell Biomaterials》：Feeder-free advances in T cell development and therapy

本综述系统梳理了无饲养层（feeder-free）技术在T细胞体外分化、成熟与激活方面的最新突破。文章重点探讨了如何利用抗体包被平板、DLL4培养系统及仿生材料抗原呈递平台（APPs）替代传统饲养细胞，以克服临床转化中标准化难、污染风险高等挑战，为生产更优T细胞产品（如CAR-T细胞）提供了标准化、可扩展的新策略。

　　

引言

T细胞疗法，包括嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法、T细胞受体工程化T细胞（TCR-T）疗法和肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）疗法，已成为治疗癌症、自身免疫性疾病和病毒感染等多种疾病的有前景的免疫治疗手段。成功的T细胞治疗关键在于确保T细胞的功能性及安全制备。T淋巴细胞遵循独特的发育路径，始于骨髓中的造血干细胞（HSCs），迁移至胸腺成为双阴性胸腺细胞，经历T细胞受体（TCR）重排、选择过程、谱系定型，最终成熟并迁移至外周免疫系统。在此过程中，饲养细胞（如胸腺微环境中的上皮细胞、树突状细胞、成纤维细胞，以及外周抗原呈递细胞APCs）为T细胞发育提供了至关重要的支持信号。为了克服饲养细胞临床应用面临的标准化和生产过程污染风险等挑战，无饲养层技术应运而生，旨在利用定义明确的分子信号（如抗体、细胞因子、仿生材料）在体外模拟这些支持功能。

无饲养层技术在T细胞分化中的进展

体外重演人多能干细胞（如HSCs、iPSCs）向T细胞的分化过程极具挑战性，因其需要模拟胸腺微环境中高度协调的信号事件和细胞间相互作用。早期方法主要依赖表达Notch配体（如DLL1或DLL4）的小鼠骨髓基质细胞系（如OP9、MS5）来促进T细胞谱系定向和成熟。尽管有效，但这些饲养细胞系统存在标准化困难和鼠源污染风险。

无饲养层技术通过提供定义的分子信号来替代基质细胞支持。初期努力表明，固定在培养板上的Fc-DLL4可支持干细胞向T细胞分化。随后发展的DL4培养系统和DL4包被微珠能在无基质细胞条件下诱导CD34⁺细胞分化为T祖细胞（proT cells），但这些祖细胞通常需要在人源化小鼠体内进行胸腺教育才能发育为成熟的功能性T细胞。

更先进的方法通过工程化胸腺样生态位，结合DLL4、血管细胞粘附分子1（VCAM-1）等关键分子和特定细胞因子组合，实现了体外生成更成熟的T细胞亚群，包括CD8⁺ T细胞、CD4⁺ T细胞、调节性T细胞（Tregs）和自然杀伤T细胞（NKT cells）。例如，一项研究报道了一种临床导向的无饲养层培养方法，能从工程化HSCs高效生成CAR-NKT细胞，产量高、纯度好，展现出强大的抗肿瘤活性。

尽管取得了显著进展，完全无饲养层分化的T细胞仍面临一些挑战，例如CD4⁺ T细胞生成相对受限导致的亚群失衡、体内持久性可能不及内源性T细胞，以及当前多数系统依赖板式培养限制了大规模自动化生产（如生物反应器应用）的可扩展性。未来的优化方向包括平衡T细胞亚群分化、改善体内持久性，并开发完全可扩展的悬浮培养平台。

无饲养层技术在T细胞成熟和激活中的进展

在T细胞疗法（尤其是CAR-T细胞）的制备中，激活和扩增T细胞是关键步骤。传统方法使用饲养细胞（如灭活的APCs）来提供TCR刺激、共刺激信号和细胞因子，但这些方法存在变异性和操作复杂性。

无饲养层技术利用合成和生物材料基的抗原呈递平台（APPs）来精确控制T细胞激活参数。早期实例包括抗CD3/抗CD28抗体包被的培养板或磁珠。商业化的GMP级产品（如Gibco Dynabeads, TransAct）进一步简化了T细胞激活流程。

新一代生物材料平台旨在更好地模拟自然抗原呈递过程。例如，细胞膜包被的纳米颗粒可提供更生理相关的抗原展示；纳米管和纳米颗粒结合物能将抗原与装载白细胞介素2（IL-2）的聚合物纳米颗粒结合，增强T细胞激活和增殖；基于介孔二氧化硅微棒的流体脂质双层系统允许激活配体的动态重排和簇集，模拟生理性抗原呈递。

特别值得关注的是能够模拟免疫突触的仿生材料。例如，氧化石墨烯抗原呈递平台（GO-APP）能通过贴合T细胞形状增加接触面积，无需外源IL-2补充即可实现有效的T细胞激活。另一项创新是合成抗原呈递细胞（SynVACs），其具有可调节的粘弹性和硬度，能模拟天然APCs的机械特性，促进记忆表型T细胞的产生，从而增强长期抗肿瘤疗效。

这些先进的APPs有助于实现稳健的T细胞成熟、增殖和功能化，同时大幅减少或消除了对外部细胞因子的需求，为生产更有效、持久的免疫疗法细胞产品提供了有前景的、可扩展且一致的平台。

未来方向

无饲养层技术为研究人类T细胞发育轨迹和生成用于治疗的T细胞产品提供了一个直接、稳健、可重复且潜在可扩展的平台。未来发展的重点在于将当前主要用于板式培养的分化技术转化为适用于生物反应器的大规模自动化生产系统。整合了DLL、VCAM-1等关键信号的先进生物材料，若能模拟基质细胞的物理特性（如形态、弹性、硬度），有望显著改善干细胞向T细胞的分化效率。

在T细胞激活和成熟方面，尽管基于抗体和细胞因子的方法已在临床中广泛应用，但大量临床前研究的仿生APPs技术（如GO-APP, SynVACs）仍需进行临床适用性评估，以确定其是否能提高T细胞生产的效率和效能。跨学科合作（科学家、临床医生、生物工程师）对于弥合实验室研究与临床应用之间的差距至关重要。同时，任何与治疗性T细胞产品直接接触的生物材料都需要有适当的清除或分离策略，以确保最终产品的安全性。

随着T细胞疗法应用范围的扩大（超越癌症，涵盖病毒感染、自身免疫性疾病、心脏病等），对标准化、可扩展、成本效益高的制造平台的需求日益增长。无饲养层技术为此奠定了基础，结合基因组编辑（如调节内源性TCR/HLA）策略，是通向通用型、“现货”疗法的一条实用路径。结合高维表型分析和功能分析，可以降低工艺开发风险，确保可扩展性与严格的细胞产品质量标准相匹配。

结论

无饲养层技术的进步极大地促进了对人类T细胞发育、成熟和激活过程的研究，并有望通过生产更优质、更有效的T细胞产品（如CAR-T细胞）来改善T细胞疗法的临床结果。