Aerith：利用稳定同位素标记技术对蛋白质组学和代谢组学中肽类及代谢物的同位素富集模式进行可视化分析与注释

《Analytical Chemistry》：Aerith: Visualization and Annotation of Isotopic Enrichment Patterns of Peptides and Metabolites with Stable Isotope Labeling from Proteomics and Metabolomics

稳定同位素探针（SIP）代谢追踪中，Aerith R包通过蒙特卡洛和FFT算法模拟多同位素化合物分布，支持用户自定义化学公式及同位素丰度，可视化质谱匹配（PSM）并优化评分函数（MVH/Xcorr/WDP）以提升谱图解析精度。

　　稳定同位素探针（Stable Isotope Probing, SIP）技术通过使用同位素重的底物（如13C、1?N或2H）追踪生物细胞的代谢过程，为理解微生物群落的功能和多样性提供了重要工具。然而，由于质谱（Mass Spectrometry, MS）数据中部分标记肽和代谢物的同位素模式模拟、可视化和注释存在挑战，因此准确识别这些同位素标记产物仍然是一个难题。为了解决这一问题，我们开发了Aerith，这是一个基于R语言的软件包，专门用于可视化模拟和实际观测到的肽和代谢物的同位素包络线（isotopic envelopes），并允许用户自定义化学式和同位素富集水平。

Aerith的核心功能在于模拟和分析SIP标记化合物的同位素分布。它通过卷积算法，将单体单元的同位素包络线依次叠加，从而生成完整的肽片段离子系列的同位素分布模型。此外，Aerith还采用蒙特卡洛模拟（Monte Carlo simulation）结合多项式分布（multinomial distribution）来模拟化合物的精细同位素结构，这种方法能够捕捉低丰度的同位素结构变体，尽管计算成本较高。为了提高计算效率，Aerith还集成了基于快速傅里叶变换（FFT）的算法，该算法保留了主要的同位素峰，并通过FFT变换和点乘操作，根据化学计量比合并各元素的同位素分布，最终得到聚合的同位素包络线。这两种算法各有优势，用户可根据需求选择模拟精细同位素结构或快速计算包络线。

在实际应用中，Aerith不仅支持对SIP标记肽和代谢物的理论光谱生成，还能够可视化实验数据与理论模型之间的对比。通过整合ggplot2绘图工具，Aerith提供了高质量的图像输出，便于在研究论文或报告中使用。软件的可视化功能允许用户输入观察到的光谱数据和理论光谱，从而直观地比较同位素标记对离子质量的影响。此外，Aerith还支持手动验证肽-光谱匹配（Peptide-Spectrum Matches, PSMs）的准确性，这对于确保SIP研究结果的可靠性至关重要。

Aerith的理论光谱生成能力使其在多种SIP研究中具有广泛应用。例如，在微生物群落代谢功能分析中，Aerith可以模拟不同同位素富集水平下的肽前体离子和B/Y碎片离子的同位素包络线，从而帮助研究人员识别特定的同位素标记。此外，Aerith还实现了对PSM评分函数的全面支持，包括多变量超几何分布（MVH）、交叉相关（Xcorr）和加权点积（WDP）等方法。这些评分函数分别适用于不同的实验条件和数据类型，例如在自然同位素丰度条件下，WDP评分函数因其对所有同位素峰的全面评估而表现出更优的分辨率；而在低分辨率质谱数据中，Xcorr和MVH评分函数则因其对最丰富同位素峰的关注和对噪声干扰的处理能力而更受欢迎。

Aerith的设计理念是为用户提供灵活且高效的工具，以应对SIP研究中的复杂需求。其模块化结构允许用户根据具体实验目的选择不同的算法和参数，从而实现对同位素标记化合物的精确模拟和分析。例如，对于小分子或已知化学结构的代谢物，FFT方法因其计算速度快、算法复杂度低而成为首选；而对于需要考虑同位素精细结构的化合物，如在分析聚同位素时，蒙特卡洛方法则更加适用。对于肽类或蛋白质这样的大分子，卷积算法则能够高效地计算碎片离子的同位素包络线，而无需重复计算每个离子的分布。

Aerith的实现采用了C++语言，通过Rcpp接口与R环境集成，确保了软件的高效运行和用户友好性。这种混合编程方式不仅提升了计算性能，还简化了用户的操作流程。用户可以通过简单的R脚本调用Aerith的功能，无需深入了解底层算法细节。同时，Aerith还支持用户自定义的同位素富集水平和化学式输入，这使得研究人员能够根据实际实验条件调整模拟参数，从而更准确地反映SIP标记的真实情况。

为了验证Aerith的有效性，我们进行了多个案例研究，涵盖了葡萄糖、青霉素以及微生物肽等多种化合物。这些案例展示了Aerith在模拟和分析不同同位素标记水平下的同位素结构和包络线方面的强大能力。通过与实验数据的对比，Aerith能够帮助研究人员更精确地注释质谱数据，并对同位素标记的肽和代谢物进行手动验证。这种手动验证的能力在SIP研究中尤为重要，因为即使算法能够提供高质量的模拟结果，仍需研究人员进行最终确认，以排除潜在的假阳性或假阴性匹配。

Aerith的可视化功能不仅限于同位素包络线的展示，还包括对肽-光谱匹配（PSMs）的全面分析。例如，在图4中，Aerith展示了肽HYAHVDCPGHADYVK在自然同位素丰度（1.07% 13C）和50% 13C富集条件下的PSMs对比。图中同时显示了观察到的峰（红色）和理论包络线（黄色），帮助研究人员直观地识别同位素标记对离子质量的影响。此外，Aerith还支持对未标记和标记肽的PSMs进行可视化比较，这对于分析微生物群落的同位素标记模式非常有用。

在性能评估方面，Aerith的三种评分函数（MVH、Xcorr和WDP）在不同实验条件下表现出不同的优势。例如，在自然同位素丰度条件下，WDP评分函数因其对所有同位素峰的全面评估而显示出更窄的得分分布，表明其在区分真实匹配方面具有更高的分辨率。而在低分辨率质谱数据中，Xcorr和MVH评分函数则因其对最丰富同位素峰的关注和对噪声干扰的处理能力而更受欢迎。这些评分函数的选择取决于实验的具体条件和目标，Aerith的灵活性使得用户可以根据需要调整评分策略。

此外，Aerith还支持对SIP标记代谢物的光谱数据进行熵值分析（spectral entropy）。这种分析方法在小分子的光谱识别中已被证明是关键特征之一，因此在SIP代谢组学研究中，Aerith的熵值评分功能可能为代谢物的准确识别提供额外的支持。通过整合这些先进的评分方法，Aerith不仅提升了SIP研究的准确性，还增强了其在复杂数据环境下的适用性。

Aerith的开发不仅为SIP研究提供了新的工具，还推动了质谱数据处理方法的创新。传统的SIP分析方法往往依赖于手动注释或有限的算法支持，而Aerith通过其强大的模拟和可视化能力，显著提高了研究效率和结果可靠性。在微生物群落的代谢功能研究中，Aerith能够帮助研究人员更准确地识别同位素标记的肽和代谢物，从而揭示微生物在不同环境中的代谢路径和功能特性。

从应用角度来看，Aerith适用于多种SIP研究场景，包括单菌株培养、热泉微生物群落、沿海海水、小鼠肠道、沼气发酵系统、地下水和厌氧反应器等。这些环境中的微生物群落代谢功能复杂，传统的分析方法难以全面解析其同位素标记模式。Aerith的引入使得研究人员能够更系统地处理和分析这些数据，从而更深入地理解微生物群落的代谢动态和功能多样性。

Aerith的用户界面友好，支持多种输入格式，包括Raxport处理后的FT2、mzML和MGF格式，以及pepXML和PIN文件（Percolator输出）、TSV文件（来自Sipros搜索引擎）等。这种多样化的输入支持使得Aerith能够兼容不同实验平台和数据来源，从而扩大了其适用范围。同时，Aerith还提供了丰富的输出选项，包括表格数据、可视化图像和交互式界面，方便用户在不同研究阶段进行数据处理和分析。

为了确保Aerith的稳定性和可靠性，我们对其进行了详尽的测试和验证。测试结果表明，Aerith在模拟同位素包络线和精细结构方面具有较高的准确性，同时在计算效率上也表现出色。特别是在处理大规模质谱数据时，Aerith的FFT方法能够显著缩短计算时间，而蒙特卡洛方法则在需要高精度模拟的情况下提供了可靠的解决方案。此外，Aerith的卷积算法在处理肽类化合物的同位素分布时，能够高效地生成碎片离子的理论光谱，这对于分析复杂蛋白质组数据尤为重要。

Aerith的可视化功能也得到了广泛认可。通过与ggplot2的集成，Aerith能够生成高质量的图像，这些图像不仅美观，而且信息丰富，能够清晰地展示同位素标记对离子质量的影响。例如，在图5中，Aerith展示了三种评分函数在不同同位素富集水平下的得分分布，这为研究人员提供了直观的比较工具，有助于选择最适合的评分方法。同时，Aerith的交互式界面允许用户实时调整参数，观察模拟结果的变化，这种灵活性对于优化实验条件和提高分析准确性非常关键。

在实际应用中，Aerith的案例研究展示了其在不同类型的SIP标记化合物分析中的优势。例如，在葡萄糖、青霉素和微生物肽的分析中，Aerith能够准确模拟和解析自然同位素丰度和高富集水平下的同位素结构，从而帮助研究人员更全面地理解这些化合物的代谢特性。此外，Aerith的理论光谱生成能力还支持对实验数据的深入分析，为同位素标记的代谢物和肽的鉴定提供了坚实的基础。

Aerith的开发团队在软件设计过程中充分考虑了用户的实际需求，确保了其在不同实验条件下的适用性。例如，Aerith支持用户自定义的化学式和同位素富集水平，这使得研究人员能够根据具体的实验设计调整模拟参数。此外，Aerith还允许用户输入观察到的光谱数据，以便进行更精确的匹配和注释。这种灵活性不仅提高了软件的实用性，还增强了其在不同研究领域的适应能力。

Aerith的发布和推广为SIP研究提供了新的可能性。通过提供高效的模拟和可视化工具，Aerith使得研究人员能够更系统地处理和分析质谱数据，从而提高研究的准确性和效率。同时，Aerith的开源性质也鼓励了更多的科研人员参与其开发和改进，进一步推动了SIP技术的发展和应用。

总之，Aerith是一个功能强大且用户友好的软件包，它通过先进的算法和直观的可视化工具，为稳定同位素探针研究提供了重要的支持。无论是用于模拟同位素标记化合物的理论光谱，还是用于解析实验数据与理论模型之间的差异，Aerith都能满足研究人员的多样化需求。随着SIP技术在微生物群落代谢研究中的广泛应用，Aerith的出现无疑将极大地促进该领域的科学进展。