基于泛基因组的长读长扩增子测序技术实现微生物群落的高分辨率分析

《Microbiome》：High-resolution profiling of bacterial and fungal communities using pangenome-informed taxon-specific long-read amplicons

本研究针对传统扩增子测序在物种和菌株水平分辨率不足的问题，开发了一种基于泛基因组信息的分类群特异性长读长扩增子测序方法。研究人员以小麦微生物组为模型，设计了针对假单胞菌属(Pseudomonas)和真菌病原体Zymoseptoria tritici的特异性3-kb扩增子，通过PacBio Sequel II测序平台实现了比全长16S和ITS高一个数量级的系统发育分辨率。该方法能够准确追踪复杂环境中微生物群落的动态变化，为微生物生态学研究提供了强有力的技术工具。

　　

微生物群落研究一直是生态学和医学领域的热点，但传统方法在分辨物种和菌株水平多样性方面存在明显局限。尽管高通量测序技术已经革命性地改变了我们对微生物组的认识，但常规扩增子测序方法如16S rRNA基因和ITS区域测序，往往只能提供属级水平的分类信息，无法揭示微生物群体中功能差异显著的菌株级别多样性。这种分辨率限制严重阻碍了我们对微生物生态功能的理解，特别是在农业生态系统和临床环境中，菌株特异性特征往往决定了微生物的生态角色和功能影响。

以小麦叶际微生物组为例，假单胞菌属(Pseudomonas)中的不同菌株可能表现出完全相反的功能特性：有些是植物病原菌，而另一些则具有促进植物生长的作用。同样，小麦主要病原真菌Zymoseptoria tritici的菌株多样性直接影响病害发展和防控效果。传统方法无法有效区分这些功能迥异的菌株，限制了我们对微生物相互作用机制的深入理解。

针对这一技术瓶颈，Stalder等人开发了一种创新的解决方案——基于泛基因组信息的分类群特异性长读长扩增子测序技术。该研究通过系统性地分析目标微生物群的泛基因组特征，设计出具有高度多态性的特异性扩增子，结合PacBio Sequel II平台的高精度长读长测序能力，成功实现了微生物群落的高分辨率分析。

研究团队采用的主要技术方法包括：基于19个高质量基因组的假单胞菌属泛基因组构建、核心区域多态性分析、引物设计与优化、自动化液体处理系统进行大规模样本处理、PacBio HiFi测序以及定制化的生物信息学分析流程。研究样本来源于瑞士苏黎世ETH田间试验站的8个欧洲冬小麦品种，在5个时间点采集的480个叶片样本，同时构建了包含10个假单胞菌菌株和2个Z. tritici分离株的模拟群落进行方法验证。

Pangenome-informed design of taxon-specific amplicons

研究人员首先建立了完整的实验流程，从泛基因组分析到引物设计、多重扩增和测序。通过构建包含19个高质量基因组的假单胞菌属泛基因组，识别出1059个核心区域，并基于核苷酸多样性筛选出最具多态性的扩增子候选序列。经过实验验证，最终选择了两个表现最佳的扩增子：一个包含rpoD基因，另一个包含ABC转运蛋白基因。对于Z. tritici，基于全球泛基因组数据选择了位于9号和13号染色体上的两个扩增子。这些特异性扩增子在模拟群落和环境样本中均表现出优异的性能。

Detection limits of taxon-specific amplicons

通过模拟群落实验，研究人员评估了新扩增子的检测限和特异性。假单胞菌特异性扩增子能够检测到低至10^-3稀释度的菌株，相当于7.5×10^-3 ng输入DNA或约1050个细胞。Z. tritici特异性扩增子可检测到10^-2稀释度的菌株。在包含植物DNA背景的稀释系列中，扩增效率未受明显影响，证明该方法适用于复杂环境样本。

Discriminant power of amplicons to resolve strain genotypes

与传统的16S和ITS扩增子相比，新开发的分类群特异性扩增子展现出显著提高的分辨能力。假单胞菌特异性扩增子分别检测到933个(rpoD)和538个(转运蛋白)ASVs，而16S扩增子仅检测到86个假单胞菌ASVs。Z. tritici特异性扩增子检测到的ASVs数量比ITS扩增子高出十倍以上。系统发育分析显示，特异性扩增子能够更准确地将ASVs分配到相应的物种，形成单系群的比例更高。

90% of the ASVs for each Pseudomonas species shown in(E) and(F).Only species with>5 ASVs were considered.E Proportion of species in the smallest subtree containing>90% of the species ASVs assigned to specific species.F Shannon diversity indices of the subtree species composition for the smallest subtree containing>90% of the ASVs assigned to specific species.GTotal number of ASVs detected by the full-length ITS amplicon and Z.tritici-specific amplicons 1 and 2,relative to the total read count per amplicon.H Phylogenetic networks(Splitstree) of Z.tritici ASVs identified using the full-length ITS amplicon and the Z.tritici-specific amplicons'>

High-resolution tracking of natural plant colonization by pseudomonads

通过时空动态分析，研究人员揭示了假单胞菌物种在小麦叶际的差异分布模式。不同假单胞菌物种和亚种在季节和冠层高度上表现出独特的丰度变化规律。例如，P. chlororaphis的不同亚种在季节动态和空间分布上存在明显差异，这种亚种水平的动态变化传统方法无法检测到。两个独立扩增子(rpoD和转运蛋白)的结果显示出良好的一致性，证明了方法的可靠性。

Within-species diversity of a major wheat pathogen

对Z. tritici基因型多样性的追踪显示，在整个流行季节中，每个叶片的ASVs数量保持相对稳定。研究人员鉴定出两组不同的基因型：一组是少数高丰度菌株，在整个生长季节持续存在；另一组是大量瞬时出现的低丰度菌株。这种高分辨率的病原体群体动态追踪为理解病害发展机制提供了新视角。

Pangenome-informed amplicon templates for additional taxa

研究还证明了该方法在其他重要微生物类群中的适用性。通过对根瘤菌(Rhizobia)、链霉菌(Streptomyces)和人类机会性病原真菌烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的泛基因组分析，鉴定出了适合引物设计的核心区域，为扩展该方法的应用范围奠定了基础。

该研究开发的基于泛基因组信息的长读长扩增子测序技术，成功克服了传统微生物群落分析在系统发育分辨率方面的限制。与核糖体标记基因相比，新方法能够提供高一个数量级的分类分辨率，实现物种和菌株级别的微生物动态追踪。这种方法特别适用于微生物生物量低、宿主DNA污染严重的环境样本，为农业生态系统、临床微生物组和环境微生物学研究提供了强大的技术工具。

研究的创新之处在于将泛基因组分析与长读长测序技术相结合，系统性地开发高分辨率标记基因。通过近10,000个反应的多重测序和自动化液体处理，证明了该方法的高通量和可扩展性。与全基因组测序相比，这种方法成本更低，对样本质量要求不高，更适合大规模环境样本分析。

该方法的应用前景广阔，不仅限于植物微生物组研究，还可扩展到人类相关微生物组、环境微生物组和工业微生物组等领域。随着高质量基因组数据的不断积累，这种基于泛基因组的设计理念可以轻松适配其他重要的微生物类群，为微生物生态学研究开辟新的可能性。