基于LAMP技术的四种马杜拉菌同步检测新方法推动真菌性足菌肿精准诊断

《Mycopathologia》：Simultaneous Detection of Four Madurella Species Using Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) for Eumycetoma Diagnosis

本刊推荐：为解决真菌性足菌肿（eumycetoma）早期诊断难题，研究团队开发了可同步检测4种马杜拉菌（Madurella）的环介导等温扩增（LAMP）技术。通过比较基因组分析筛选特异性靶点，新引物组可实现1 pg基因组DNA的灵敏检测，且不与其它病原体交叉反应。该技术为偏远地区提供了快速、简便的诊断方案，显著提升诊疗效率。

　　

在热带地区的医疗实践中，有一种被称为"被忽视的疾病"正悄然影响着数百万人的健康——真菌性足菌肿（eumycetoma）。这种慢性肉芽肿性疾病最初表现为无痛性皮下肿胀，却会逐渐侵蚀皮下组织，甚至导致骨骼破坏。由于病程缓慢且早期症状不典型，患者往往延误就医，等到确诊时已面临截肢的风险。

在真菌性足菌肿的致病菌中，马杜拉菌属（Madurella）占据重要地位，其中马杜拉足菌肿菌（M. mycetomatis）是最常见的病原体。然而近年来，研究人员发现伪马杜拉菌（M. pseudomycetomatis）、热带马杜拉菌（M. tropicana）和法哈氏马杜拉菌（M. fahalii）同样能引起临床感染。传统的真菌培养鉴定方法耗时长且需要专业实验室支持，而聚合酶链反应（PCR）等分子诊断技术虽然准确度高，但对仪器设备和操作环境要求较高，难以在资源有限的农村地区推广。

面对这一诊断困境，日本千叶大学医学真菌研究中心的Isato Yoshioka教授团队与苏丹喀土穆大学足菌肿研究中心等机构合作，开发了一种创新的检测方案。他们的研究成果发表在《Mycopathologia》期刊上，题为"利用环介导等温扩增（LAMP）技术同步检测四种马杜拉菌用于真菌性足菌肿诊断"。

研究人员采用了几项关键技术方法：通过对伪马杜拉菌IFM 46460株进行牛津纳米孔技术（ONT）全基因组测序，结合已公开的马杜拉菌及相关菌种基因组数据，利用SwiftOrtho和VSEARCH软件进行比较基因组分析；从40个马杜拉菌属特异性保守基因中筛选出3个靶点（MMYC01_204841、MMYC01_205181、MMYC01_210211），设计LAMP引物组；使用来自22种真菌和5种细菌的37株菌株验证引物特异性，并通过梯度稀释实验确定检测灵敏度。

基因组测序与比较分析

研究团队首先完成了伪马杜拉菌IFM 46460株的染色体基因组测序，获得了总长度为40,045,822 bp的6个支架，N50值为25,195,283 bp。基因注释结果显示该菌株含有11,334个蛋白质编码基因，其真核生物通用单拷贝直系同源基因（BUSCO）完整度达到99.6%。通过与马杜拉菌属及其近缘物种（毛壳科和柄孢壳科）的比较基因组分析，研究人员筛选出40个马杜拉菌属特异性保守基因，为引物设计提供了理论基础。

LAMP引物设计与优化

基于比较基因组分析结果，研究团队针对三个候选基因设计了LAMP引物组。温度优化实验表明66°C为最佳反应温度，灵敏度测试显示所有引物组均可检测到低至1 pg的马杜拉足菌肿菌基因组DNA。特别值得注意的是，引物组#1和#3对所有四种马杜拉菌均表现出良好的检测能力，而引物组#2对法哈氏马杜拉菌的检测效果不佳。

特异性与灵敏度验证

在特异性验证实验中，引物组#1和#3仅对马杜拉菌属产生特异性扩增，与其它致病真菌和细菌无交叉反应。针对1 pg的基因组DNA，这些引物组可在45分钟内完成检测，显示出良好的实时监测特性。研究人员特别强调，引物组#1在检测四种马杜拉菌时表现出均衡的灵敏度，而引物组#3对法哈氏马杜拉菌低浓度DNA样本的反应性相对较弱。

研究结论与意义

本研究成功开发了能够同步检测四种马杜拉菌的LAMP引物组，特别是引物组#1展现出优异的综合性能。与之前需要2-3个独立反应才能完成马杜拉菌种鉴定的方法相比，新方法实现了"单管多重检测"的突破，显著简化了操作流程，降低了检测成本。这种改进对于医疗资源匮乏的农村地区尤为重要，为真菌性足菌肿的早期诊断提供了实用工具。

然而，研究人员也指出本研究目前仅限于纯培养菌株DNA的检测，未来需要进一步验证该方法在临床颗粒样本中的实际应用效果。此外，开发更适合现场使用的检测读值方法（如比色法或荧光法）也将是下一步研究的重点。

这项研究的创新之处在于将基因组学分析与现场适用诊断技术相结合，为应对被忽视热带病挑战提供了新思路。通过比较基因组学方法筛选特异性靶点，再结合LAMP技术的操作简便性，研究团队成功搭建了从基础研究到临床应用的桥梁。这种研究策略不仅适用于真菌性足菌肿的诊断改进，也为其他传染病的快速检测技术开发提供了可借鉴的模式。

随着这项技术的进一步完善和推广，偏远地区的医疗工作者将能够更快速、准确地诊断真菌性足菌肿，为患者争取宝贵的治疗时间。这不仅有助于降低疾病的致残率，也能减轻患者的经济负担，实现WHO提出的"不被忽视的疾病"防控目标。这项研究标志着真菌性足菌肿诊断领域的重要进展，为全球热带病防治工作贡献了新的解决方案。