对外周血单核细胞进行全面的实时代谢分析，揭示了免疫代谢研究中的重要方法学考量

《Frontiers in Immunology》：Comprehensive real-time metabolic profiling of peripheral blood mononuclear cells reveals important methodological considerations for immunometabolism research

本研究通过优化PBMCs实时荧光代谢分析流程，发现血液处理时间超过24小时和SepMate?分离法会显著降低线粒体呼吸功能，导致红细胞污染并干扰糖酵解测量，而EasySep? Direct方法在处理延迟时保持更稳定的代谢参数。研究提出标准化处理流程和分离方法以提升PBMC代谢评估的可靠性。

　　在现代生物医学研究中，细胞代谢分析已经成为理解免疫系统功能及其在疾病状态下的变化的重要工具。特别是，外周血单个核细胞（PBMCs）作为研究对象，因其在循环系统中长期暴露于营养和代谢信号，被认为是评估全身代谢状态的潜在生物标志物。然而，尽管PBMCs在代谢研究中具有重要价值，其代谢分析仍然面临诸多挑战，尤其是在实验操作过程中可能引入的变量，例如血液处理时间、分离方法以及实验条件的标准化问题。这些因素可能显著影响代谢参数的准确性和可重复性，从而限制了PBMC代谢分析在临床和研究中的应用潜力。

本研究旨在通过优化实验流程，探讨血液处理时间与分离方法对PBMC代谢特征的影响。研究采用实时外细胞通量分析（extracellular flux analysis, XF分析）技术，对PBMCs的线粒体呼吸作用和糖酵解活性进行综合评估。XF分析能够实时测量细胞的氧气消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR），从而提供关于细胞能量代谢的动态信息。在优化实验条件的过程中，研究团队对PBMCs的接种密度进行了系统评估，并开发了一种结合多种试剂注射的策略，以在同一实验过程中同时分析线粒体和糖酵解功能。此外，研究还评估了不同分离方法（SepMate?与EasySep? Direct）对代谢参数的影响，并进一步探讨了血液处理时间对PBMC代谢功能的潜在影响。

通过分析不同处理时间（0小时、24小时、48小时、72小时）和分离方法的PBMC样本，研究发现，血液处理时间越长，PBMC的线粒体功能和糖酵解能力均受到显著影响。具体而言，处理时间超过24小时的PBMC样本显示出线粒体呼吸作用的下降，同时伴有糖酵解活动的增强。这种代谢变化在SepMate?分离方法中尤为明显，原因可能与红细胞污染有关。红细胞主要依赖糖酵解获取能量，因此其污染可能导致PBMCs的糖酵解活动被高估。此外，研究还发现，使用铵盐（如NH4Cl）去除红细胞的过程会对PBMCs的代谢状态产生负面影响，尤其是在线粒体功能方面。这表明，在进行PBMC代谢分析时，选择合适的分离方法和处理时间至关重要，以避免不必要的干扰因素。

在评估不同接种密度对代谢参数的影响时，研究发现，当接种密度低于1×10^5细胞/孔时，OCR和ECAR值接近或低于XFe96分析仪的检测范围，无法提供可靠的代谢数据。而当接种密度超过3×10^5细胞/孔时，代谢参数的线性关系被破坏，导致数据的不一致和不可靠。因此，研究团队确定了1×10^5至3×10^5细胞/孔为最佳接种密度范围，以确保OCR和ECAR的准确测量。这一发现不仅提高了实验的可重复性，也为后续研究提供了可操作的指导。

在分析实验数据时，研究采用了多种高级代谢控制分析方法，包括线粒体呼吸控制比（RCR）、生物能健康指数（BHI）和线粒体毒性指数（MTI）。这些指标能够全面反映线粒体功能的动态变化。研究发现，BHI在较长时间的血液处理（72小时）后仍能保持相对稳定，而RCR和MTI则在处理时间达到48小时时就开始出现显著变化。这一现象提示我们，虽然BHI是一个综合性的指标，能够在一定程度上反映线粒体功能的持续性变化，但其对处理时间的敏感性可能不如其他更具体的指标。因此，在选择代谢分析的指标时，需要根据实验目的和临床应用的具体需求进行权衡。

此外，研究还探讨了不同处理时间对T细胞激活能力的影响。通过使用CD3/CD28激活剂，研究团队发现，血液处理时间越长，PBMCs在激活后的代谢响应能力越弱。特别是在SepMate?分离方法中，处理时间超过48小时的PBMC样本在激活后的ATP供应能力显著下降，这可能是由于线粒体功能受损以及糖酵解活动的补偿机制未能有效维持细胞的能量需求。因此，及时处理血液样本对于保持PBMCs的免疫功能和代谢完整性至关重要。

为了进一步提高PBMC代谢分析的准确性，研究团队提出了一系列最佳实践建议。这些建议包括推荐使用EasySep? Direct分离方法，特别是在处理时间超过24小时的情况下，以减少红细胞污染对糖酵解测量的干扰。同时，建议在接种密度控制在1×10^5至3×10^5细胞/孔范围内，以确保OCR和ECAR的可靠测量。此外，研究还强调了对PER值进行线粒体贡献修正的重要性，以避免因线粒体CO2酸化对糖酵解测量的干扰。

本研究的成果不仅为PBMC代谢分析提供了实验优化方案，也为免疫代谢研究在临床转化中的应用提供了重要的方法学支持。通过系统评估关键实验变量的影响，研究团队为研究人员和临床医生提供了一套完整的实验流程和数据分析方法，从而提升了PBMC代谢分析的可靠性。这些发现表明，标准化的实验流程和对处理时间的严格控制对于确保PBMC代谢研究的科学性和临床价值至关重要。未来的研究应进一步探索这些代谢参数在特定疾病状态下的应用潜力，并结合其他生物标志物（如线粒体DNA含量）进行更全面的评估，以推动PBMC代谢分析在个性化医疗和疾病监测中的广泛应用。