推进宫颈癌筛查：用于p16和Ki-67同步检测的新型内部ELISA检测方法的开发

《Journal of Immunological Methods》：Advancing cervical cancer screening: A novel in-house ELISA assay for the simultaneous detection of p16 and Ki-67

本文报道了一种创新型内部ELISA检测方法，成功实现了宫颈/阴道样本中p16和Ki-67蛋白的同步检测。该研究通过优化定制抗体和实验流程，显著提升了检测灵敏度（p16 LoD达0.00004μg/mL）与特异性，突破了传统免疫染色技术对病理医师的依赖性，为宫颈癌（Cervical Cancer）筛查管理提供了自动化、可量化的解决方案。

　　

亮点

材料

我们特别定制了p16和Ki-67捕获抗体，以及定制生物素标记的Ki-67二抗和纯化的p16、Ki-67蛋白，这些关键试剂均来自ProteoGenix公司（法国施利蒂盖姆）。生物素标记的p16二抗、链霉亲和素-HRP（辣根过氧化物酶）、Nunc? MaxiSorp? 96孔微孔板和四甲基联苯胺（TMB）底物则购自Antigenix America公司（美国纽约）。我们还采购了磷酸盐缓冲盐水（PBS）粉末、IGEPAL? CA-630、TWEEN? 20和TERGITOL?溶液等常用试剂。

ELISA检测方法的优化

本研究优化的ELISA实验方案基于夹心ELISA原理，并参考文献进行了改进。在原始方案中，每个微孔板孔需包被100μL捕获抗体（p16或Ki-67捕获抗体），并在室温下孵育过夜。接着，用100μL封闭剂（PlateBlock）处理孔板两小时，以防止后续步骤中蛋白质的非特异性结合。

结论

这是首次专门为宫颈癌筛查开发ELISA检测方法，我们的结果表明，所构建的检测方法与以不同方式收集并储存于各种保存液中的宫颈/阴道液样本均具有良好的兼容性。考虑到这些蛋白质的细胞内特性，我们还为此目的优化了样本前处理步骤。

由于这些生物标志物日益重要，但其在宫颈癌中的参考范围尚未确定，因此本研究开发的检测方法可用于未来研究，以确定在不同环境下收集的样本、针对不同宫颈病变等级（CIN分级）的蛋白质阈值。