基于核酸外切酶III辅助扩增和DNAzyme介导比率型电化学传感平台的循环肿瘤DNA超灵敏检测新方法

《Microchemical Journal》：Exonuclease III-assisted amplification and DNAzyme-mediated ratiometric electrochemical biosensor for ultrasensitive detection of circulating tumor DNA

本文开发了一种集成核酸外切酶III（Exo III）辅助扩增与DNAzyme催化切割的比率型电化学传感器，通过双信号校正机制（MB/Fc）实现了对循环肿瘤DNA（ctDNA）的超灵敏检测。该策略利用发夹探针简化设计，在100 fM-10 nM范围内呈现优异线性关系，检测限达5.34 fM，为肿瘤精准诊断提供了高效技术平台。

　　

可行性验证

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）验证了传感器的可行性（图1A）。S1与短互补链S2退火后电泳迁移率明显下降，证实S1/S2复合物形成（泳道1、2）。目标ctDNA与S1/S2复合物竞争结合导致S1/ctDNA条带变浅，同时释放的S2触发后续级联反应。当Exo III存在时，H1和H2-MB发夹探针被切割，产生明显的新条带（泳道5），表明DNAzyme（S3）和S4-MB报告分子成功释放。

分析性能评估

在最优条件下，传感器对PIK3CA E545K ctDNA的响应如图2A所示。随着目标浓度增加（100 fM至10 nM），二茂铁（Fc）氧化电流（I_Fc）逐渐降低，而甲基蓝（MB）还原电流（I_MB）显著升高。以I_MB/I_Fc比值为输出信号时，在100 fM-10 nM范围内呈现良好线性关系（图2B），检测限低至5.34 fM。该传感器对单碱基突变序列表现出高特异性（图2C），且在人血清加标实验中回收率达97.1%-104.0%，证明其在实际样本中的可靠性。

结论

本研究提出了一种新型比率型电化学传感策略，通过整合Exo III辅助循环放大与DNAzyme介导的切割放大模块，实现了对循环肿瘤DNA（ctDNA）的超灵敏检测。目标ctDNA通过与S1/S2复合物特异性结合触发探针激活，经两级酶促反应实现信号指数级放大。比率检测模式有效克服背景干扰，为肿瘤早期筛查提供了高精度解决方案。