利用多自动对焦离轴数字全息技术实现快速、稳健的多目标浮游生物成像

《Optics and Lasers in Engineering》：Fast and robust multi-object plankton imaging using multi-autofocusing off-axis digital holography

数字全息术（DH）用于原位观测浮游生物，但存在重建速度慢、图像质量差、可靠性不足等问题。本文提出多自聚焦离轴DH方法，通过轴向滑动最小融合策略快速整合目标场切片，动态定位所有兴趣区域（ROI），并采用混合度量函数（HMF）精确聚焦不同深度物体，显著提升重建速度、图像质量和稳定性，适用于复杂水下环境。

　　数字全息技术（Digital Holography, DH）因其非破坏性、高分辨率和大景深等特点，已被广泛应用于浮游生物的原位观测。然而，当前的原位数字全息技术仍面临诸多挑战，包括重建速度较慢、图像质量欠佳以及可靠性不足等问题。为了解决这些限制，本文提出了一种多自动聚焦的偏轴数字全息方法（Multi-Autofocusing Off-Axis Digital Holography, MAODH），旨在实现快速且稳健的多目标浮游生物成像。该方法通过引入轴向滑动最小值融合策略，能够迅速整合目标区域的图像切片，从而实现所有感兴趣区域（Region of Interest, ROI）的动态定位。同时，结合一种混合度量函数，精确地对ROI内的所有对象进行聚焦，适应性地确定其最佳焦距，最终实现对全息图中所有浮游生物的高保真度和高稳定性重建。实验结果表明，与传统方法相比，该方法在重建速度、成像精度和稳定性方面均得到了显著提升。

浮游生物是海洋生态系统中的基础组成部分，不仅支撑着全球碳循环，还促进了能量传递，并维持了海洋食物链的稳定。对这些微小生物进行成像，可以提供宝贵的资料，用于评估海洋健康状况、保护生物多样性以及应对全球环境变化。然而，传统的测量方法，如显微镜和视频成像技术，由于浮游生物体积小且分布广泛，存在采样效率低、空间分辨率有限以及实时监测能力差等问题。相比之下，数字全息技术（Digital Holography, DH）在浮游生物研究中展现出强大的潜力，其具备卓越的系统稳定性、扩展的景深以及实时三维重建的能力。更重要的是，数字全息技术能够实现原位测量，有效减少样本制备过程中产生的干扰和伪影。其大景深特性使得在复杂的水下环境中，可以同时捕捉多个平面的信息，从而显著提高成像效率。此外，数字全息技术无需机械移动样本，利用其三维成像能力，可以全面分析浮游生物的形态、动态和行为。

数字全息技术主要分为轴向（in-line）和偏轴（off-axis）两种配置。轴向数字全息因其光学结构简单、系统稳定性高和分辨率优异，成为水下测量的首选方案。然而，这种配置存在零阶和双像干扰无法分离的问题，这会降低聚焦精度和测量可靠性。为了缓解这种双像串扰，研究者们提出了多种方法，包括压缩感知、相位恢复和神经网络等。然而，这些方法往往计算量较大，且对串扰的抑制效果有限。相比之下，偏轴数字全息通过引入参考光束与物体光束之间的角度偏移，能够在频域中实现真实图像项与其他成分的空间隔离，从而有效抑制零阶和双像干扰。快速傅里叶变换（Fast Fourier Transform, FFT）是偏轴数字全息中用于复振幅提取的主要方法。然而，FFT处理的频谱分辨率限制使得精确的条纹频率确定变得困难，导致残留的相位倾斜等伪影问题。为了解决这一问题，Mandeep等人提出了一种局部离散傅里叶变换（Local Discrete Fourier Transform, LDFT）方法，用于亚像素载波频率检测，实现了无相位倾斜的复振幅解调，并提高了恢复速度。因此，结合LDFT等技术的偏轴数字全息能够有效提升水下测量的精度和速度，同时避免了轴向数字全息中固有的双像串扰问题。

为了获得清晰的浮游生物图像，全息图必须进行适当的再聚焦。传统的自动聚焦方法主要针对单个目标进行优化，但当全息图中存在多个深度分布不同的目标时，聚焦于一个目标可能会受到其他不同轴向位置的目标干扰，使得传统的单平面检测方法失效。为此，已有多种方法被提出用于多目标全息重建，通常包括三个关键步骤：全息切片重建、感兴趣区域（Region of Interest, ROI）检测和自动聚焦。全息重建通常采用菲涅尔变换、卷积或传递函数等方法，将全息图数值传播到多个深度平面，生成目标场的切片图像。卷积和传递函数方法相较于菲涅尔变换更受青睐，因为它们能够在不同传播距离下保持一致的观察平面尺寸。随后，这些切片图像会被融合成扩展焦图像（Extended Focus Image, EFI），其中所有目标都处于清晰状态。EFI可以通过二值化和形态学操作提取ROI。在图像融合方面，空间域和变换域方法被广泛使用。空间域方法通常依赖于像素级的方差或图像块的对比度，其中轴向方差融合（Axial Variance Fusion, AVF）因其速度较快且计算成本较低而受到青睐。然而，这些方法对散斑噪声非常敏感，导致融合效果不佳。相比之下，变换域方法通过合并变换系数进行图像融合，其中基于小波的融合（Wavelet-Based Fusion, WBF）因其简单性、高质量以及符合人眼视觉感知的特点而被广泛采用。然而，WBF方法在计算上较为繁琐且耗时较长。自动聚焦则通过评估不同切片中ROI的清晰度，确定每个目标的最佳焦平面，从而完成多目标重建。已有多种聚焦度量方法被提出，包括灰度值分布方差（Variance of Gray Value Distribution, VAR）、拉普拉斯算子、Tenengrad（TENG）、离散余弦变换系数（Discrete Cosine Transform, DCT）以及特征值（Eigenvalues, EIG）等。然而，这些方法在实际应用中仍存在聚焦稳定性差或聚焦精度低的问题。

近年来，基于深度学习的全息重建方法逐渐受到关注。然而，大多数现有研究主要集中在单目标重建，而非多目标、大景深的水下场景。为了应对这一挑战，Bachimanchi等人采用RU-Net网络，对浮游生物的三维位置进行粗略定位，并观察了不同物种之间的捕食行为。然而，该方法未能实现对浮游生物图像的重建。随后，Hu等人提出了Holo-Net方法，用于ROI检测和多目标图像重建。尽管如此，由于训练标签使用的是轴向全息图，这种配置引入的双像伪影在学习过程中造成了不确定性，限制了重建的保真度。Xu等人进一步开发了一种改进的A-Unet网络，实现了高质量的多目标重建。他们通过使用模拟全息图和基于两步相移数字全息算法重建的图像作为训练标签，成功地从单个全息图中重建了多个浮游生物。尽管这些方法在理论上取得了进展，但在实际应用中仍面临诸多挑战。例如，获取高质量的训练标签对于分布在不同深度的浮游生物仍然困难，且这些方法尚未实现完整的三维定位。总体而言，虽然深度学习在全息重建方面展现出巨大的潜力，但其性能仍然高度依赖于训练标签的质量和数据集的多样性。与传统的图像重建任务不同，全息图像的重建需要更严格的标签标准，因为可靠的基准数据不仅需要专业知识，还必须精确处理衍射传播过程，并依赖于先进的成像系统。

为了解决水下原位数字全息技术在计算成本高、稳定性差和成像质量有限等方面的问题，本文提出了一种多自动聚焦偏轴数字全息方法（Multi-Autofocusing Off-Axis Digital Holography, MAODH），用于快速且稳健的多目标浮游生物成像。该方法采用轴向滑动最小值融合策略（Axial Sliding Minimum Fusion, ASMF），通过整合聚焦图像的最小强度特征和轴向滑动平均滤波，实现了高效的计算同时保持优秀的图像融合质量。此外，引入了相位梯度L1范数度量（Phase Gradient L1-norm Metric, GL1M）来评估相位图像的清晰度。通过进一步将VAR度量函数与GL1M相结合，构建了混合度量融合模块（Hybrid Metric Fusion, HMF），从而提升了自动聚焦的稳定性和适应性，确保对具有不同振幅-相位特性的浮游生物进行准确成像，并减少了由于相位包裹造成的聚焦不稳定问题。总体而言，MAODH方法在计算速度、图像质量以及聚焦稳定性方面均取得了显著提升，为水下原位数字全息测量提供了一种高效且可靠的技术方案。

MAODH方法的工作流程如图1所示，主要包括三个关键步骤：全息切片重建、ROI检测和多自动聚焦。在第一步中，全息切片重建通过从获取的偏轴全息图中提取真实图像项，得到物体在图像平面上的复振幅。随后，通过数值传播方法，将该复振幅传播到多个深度平面，生成物体场的切片图像。第二步是ROI检测，通过图像处理技术，如二值化和形态学操作，从这些切片图像中提取出感兴趣区域。第三步是多自动聚焦，通过混合度量融合模块，对每个ROI内的目标进行精确聚焦，确定其最佳焦距，从而实现高质量的图像重建。该方法不仅能够有效提升图像重建的效率，还能在复杂水下环境中保持较高的成像质量，适用于多种不同类型的浮游生物成像需求。

在实验部分，如图2所示，偏轴数字全息系统采用了一种马赫-曾德尔干涉仪，使用了一台5mW的氦氖激光器（波长为632.8nm）。发射的激光束通过一个20倍的物镜和一个焦距为250mm的平凸透镜进行扩展和准直。准直后的激光束由第一个分束器分为两路：一路作为参考光束，另一路则进入测量臂，穿过一个玻璃水族箱（尺寸为50mm×50mm×50mm），携带目标信息。这种方法能够有效地减少样本制备过程中的干扰，提高成像的准确性和稳定性。通过MAODH方法，实验结果表明，该技术能够在较短时间内完成多目标的高质量图像重建，同时保持较高的图像清晰度和减少聚焦误差。

本文的结论指出，提出的多自动聚焦偏轴数字全息方法（MAODH）能够有效应对水下原位浮游生物成像中的关键挑战，包括重建速度慢、图像质量差和可靠性不足等问题。通过整合轴向滑动最小值融合策略，该方法实现了对所有ROI的快速动态定位。同时，混合度量融合模块（HMF）能够适应性地确定每个目标的最佳焦距，确保全息图中所有浮游生物的精确和高保真度重建。实验验证表明，该方法在水下环境中具有良好的应用前景，能够显著提升图像重建的效率和质量，为浮游生物的原位观测提供了一种全新的解决方案。

此外，本文的作者贡献声明表明，Yanjun Xu负责撰写原始草稿、可视化、软件开发、方法论设计、数据管理以及概念构思。Lei Liu参与了撰写、审阅与编辑、验证和形式分析。Yan Sun也参与了撰写、审阅与编辑以及数据管理。Bin Liu负责验证、调查和形式分析。Zhi Zhong参与了验证、资源获取和数据管理。Lei Yu负责验证、调查和形式分析。Mingguang Shan则负责撰写、审阅与编辑、资金获取以及概念构思。所有作者均声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所报告的研究工作。

本文的致谢部分提到，该研究得到了中国黑龙江省自然科学基金重点项目（项目编号：ZD2024F002）、海南省重点研发计划（项目编号：ZDYF2024GXJS004）以及哈尔滨工程大学重点基础研究稳定支持计划（项目编号：KYWZ220240805）的资助。这些支持为研究提供了必要的资金和资源，使得多自动聚焦偏轴数字全息方法的开发和实验验证得以顺利进行。

综上所述，本文提出了一种创新的多自动聚焦偏轴数字全息方法（MAODH），旨在解决水下原位浮游生物成像中的关键问题。通过引入轴向滑动最小值融合策略和混合度量融合模块，该方法不仅提升了图像重建的速度和质量，还增强了系统的鲁棒性，使其能够在复杂的水下环境中稳定运行。实验结果表明，MAODH方法在多个方面均优于传统方法，具有广阔的应用前景。未来的研究可以进一步优化算法，提高计算效率，并探索其在更广泛生物成像领域的应用潜力。