CUT&Tag技术突破ChIP偏见，揭示重复基因组位点的染色质新模式

《iScience》：CUT&Tag overcomes biases of ChIP and establishes chromatin patterns for repetitive genomic loci

本研究针对传统ChIP-Seq技术在异染色质区域检测存在的技术偏见问题，通过系统比较CUT&Tag与ChIP-Seq技术平台，发现CUT&Tag能够有效检测H3K9me3等抑制性组蛋白修饰在年轻重复元件（如IAPEz-int）上的富集，而ChIP-Seq则因交联和超声偏好性丢失了这些异染色质区域。该研究为重复元件的表观遗传调控研究提供了更可靠的技术方案，对发育和疾病研究具有重要意义。

　　

在表观遗传学研究领域，染色质修饰的基因组定位一直是理解基因表达调控的关键。然而，传统的染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq）技术存在明显局限性——它就像一把不够精确的尺子，在测量基因组中高度压缩的异染色质区域时总是出现偏差。这些区域富含重复序列和逆转录转座子，虽然占基因组的很大部分，却因技术限制而成为研究的"盲区"。

Brandon J. Park、Shan Hua等研究人员在《iScience》上发表的最新研究揭示了这一问题的严重程度。他们发现，ChIP-Seq技术由于依赖交联和超声破碎染色质，导致开放染色质区域（如基因启动子）被过度代表，而异染色质区域则因不易破碎而丢失在不溶性沉淀中。这就好比渔网的网眼太大，只能捕捉到大鱼（启动子区域），而让小鱼（重复元件）溜走。

为了克服这一技术瓶颈，研究团队系统比较了新兴的原位染色质图谱技术CUT&Tag与传统ChIP-Seq的性能差异。CUT&Tag技术采用Tn5转座酶直接在染色质目标位点进行切割，无需交联和超声处理，理论上应该能够更全面地捕捉全基因组的染色质特征。

研究团队运用了多种关键技术方法：通过CUT&Tag和CUT&RUN进行原位染色质图谱分析，利用模拟ChIP-Seq实验比较可溶性与不溶性染色质组分的基因组分布差异，采用质谱技术鉴定与异染色质共纯化的蛋白质组分，并对小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）、小鼠胚胎干细胞（mESCs）以及人类癌细胞等多种模型系统进行跨物种比较。

ChIP-Seq存在基因启动子偏好性和异染色质区域丢失问题

研究人员通过分析公共数据库中的ChIP-Seq输入样本数据发现，高富集区域更靠近基因转录起始位点（TSS），富含基因启动子，且与染色质可及性（ATAC-Seq信号）高度相关。这表明ChIP-Seq确实存在对开放染色质区域的检测偏好。

CUT&Tag与ChIP-Seq在H2A.Z、H3K27ac和H3K27me3检测中表现一致，但在H3K9me3检测中存在显著差异

对比四种染色质修饰（H2A.Z、H3K27ac、H3K27me3和H3K9me3）的富集模式发现，前三种修饰在两种技术中表现相似，而H3K9me3的富集区域在ChIP-Seq和CUT&Tag中差异显著。ChIP-Seq检测到的H3K9me3区域更靠近基因TSS，而CUT&Tag发现的区域则更多位于基因间区。

交联和超声导致异染色质在ChIP-Seq中丢失

模拟ChIP-Seq实验显示，可溶性染色质（ supernatant）富含启动子和开放染色质特征，而不溶性沉淀（pellet）则富含异染色质区域。质谱分析进一步证实，沉淀中含有大量已知的异染色质相关蛋白，如着丝粒和核仁相关蛋白。

CUT&Tag能够检测年轻重复元件上的H3K9me3修饰

通过k-means聚类分析，研究人员发现CUT&Tag特异富集的H3K9me3区域富含LTR家族逆转录转座子。特别值得注意的是，进化上年轻的LTR元件（如RLTR10-int、RLTR6_Mm和IAPEz-int）在CUT&Tag中显示出强烈的H3K9me3信号，而在ChIP-Seq中几乎检测不到。

不同ChIP-Seq数据集对重复位点的检测能力存在差异

分析三个独立的H3K9me3 ChIP-Seq数据集发现，虽然ENCODE数据集表现优于其他两个，但在检测年轻LTR元件方面仍不如CUT&Tag。这表明即使优化ChIP-Seq实验条件，也难以完全克服其技术局限性。

CUT&Tag在多物种中一致检测重复元件的染色质特征

在小鼠和人类多种细胞类型中，CUT&Tag均能一致地检测到H3K9me3、H2A.Z和H3K27me3在年轻重复元件上的富集，证明了该技术的可靠性和广泛应用潜力。

异染色质中富集"常染色质因子"

质谱分析意外发现，许多传统认为在常染色质中发挥功能的蛋白（如BRD4、RUNX1等）在与异染色质共纯化的沉淀组分中富集。通过重新分析公共CUT&RUN数据，证实RUNX1确实能够结合人类癌细胞中的特定重复元件。

本研究系统揭示了ChIP-Seq技术存在的系统性偏见，证实CUT&Tag等原位染色质图谱技术能够更全面、准确地检测重复基因组位点的染色质特征。这不仅对表观遗传学研究领域具有方法论上的重要意义，更为理解重复元件在发育和疾病中的作用提供了新的技术途径。研究人员强调，随着T2T-CHM13等完整基因组组装的出现，结合CUT&Tag等先进技术，重复元件研究即将进入"黄金时代"，有望在基础生物学和疾病机制研究中带来突破性发现。

该研究的局限性包括不同数据集间抗体和测序参数的差异，以及仅聚焦于少数染色质特征等。未来研究需要进一步探索其他染色质因子是否也存在类似的ChIP偏见，并比较不同酶切方法（如MNase-based与Tn5-based）的技术差异。