利用镜像噬菌体展示技术鉴定出的趋化因子结合全D-CLIPS肽

《ACS Chemical Biology》：Chemokine-Binding All-D-CLIPS Peptides Identified Using Mirror-Image Phage Display

化学交联肽合成（CLIPS）结合镜像噬菌体展示技术成功筛选出4个对CXCL8具有亚微摩尔亲和力的D-氨基酸肽，其结构特征（β折叠、疏水/芳香残基组合）和功能验证（解离CXCL8二聚体、抑制与GAGs结合但不影响细胞迁移）为炎症相关疾病治疗提供新策略。

　　在炎症反应中，趋化因子（Chemokines）作为一种小分子分泌蛋白，具有引导白细胞迁移的重要功能。这些趋化因子通过与G蛋白偶联受体结合，调节细胞的定向运动，从而在免疫应答、组织修复和病理过程中发挥关键作用。因此，中和趋化因子成为治疗炎症相关疾病的一种潜在策略，例如动脉粥样硬化、心肌梗死、中风和关节炎等。然而，由于趋化因子的结构相对简单，缺乏深层结合口袋，传统的药物分子中和趋化因子的难度较大，目前仅有少数针对特定趋化因子（如CCL2和CXCL12）的研究报道。相比之下，肽类分子因其较高的结构多样性和可调节的分子量（500-5000 Da），成为一种更有潜力的候选分子，尤其适用于那些难以通过传统药物手段靶向的“不可成药”靶点。

为了提高肽类分子的代谢稳定性，研究者们探索了多种策略，其中一种是使用非天然的D-氨基酸代替天然的L-氨基酸，以增强肽键对蛋白酶的抵抗力。D-氨基酸的引入不仅能够提高肽的抗降解能力，还可能增强其口服生物利用度并降低免疫原性，从而提高其作为治疗分子的可行性。基于此，科学家们开发了一种“镜像显示”（mirror-image phage display）技术，通过构建D-氨基酸的肽库，筛选能够特异性结合目标趋化因子的D-肽。这种方法能够利用天然的生物分子机制，生成并筛选数以十亿计的肽序列，其规模远超传统合成库的范围。

本研究中，科学家们利用镜像显示技术，成功筛选出一系列环状的D-肽，这些D-肽能够以亚微摩尔的亲和力结合C–X–C趋化因子配体8（CXCL8），并且在结合过程中表现出不同的选择性。值得注意的是，这些D-肽不仅能够中和CXCL8，还能破坏其二聚体结构，并干扰其与糖胺聚糖（GAGs）的结合，但对体外细胞迁移没有明显影响。这表明，这些D-肽可能通过干扰趋化因子与GAGs的相互作用，间接抑制炎症反应，而不直接阻断细胞迁移这一关键过程。这种特性使得它们在炎症治疗中具有独特的应用潜力，尤其是在需要避免影响正常免疫反应的情况下。

为了实现镜像显示技术，研究团队首先合成了D-形式的CXCL8蛋白。这一合成过程采用了三段法的天然化学连接（Native Chemical Ligation, NCL），并结合固相肽合成（Solid-Phase Peptide Synthesis, SPPS）技术。通过分段合成和连接，最终获得了完整的D-CXCL8蛋白，并通过氧化折叠使其形成正确的三维结构。实验结果显示，D-CXCL8的圆二色谱（CD spectrum）与L-CXCL8相似，表明其折叠状态良好，具备与天然L-形式趋化因子相互作用的能力。

接下来，研究团队利用镜像显示技术对D-CXCL8进行了筛选，构建了一个包含10个随机氨基酸的肽库。通过三轮筛选，最终获得了具有较高结合亲和力的D-肽，并通过下一代测序（Next-Generation Sequencing, NGS）对筛选结果进行了分析。分析显示，这些D-肽在序列多样性上表现出显著差异，可以分为四个不同的簇，每个簇中的肽具有相似的保守序列模式。例如，簇1和簇4的D-肽中均包含Ile–(Xxx)₂–Asp–(Xxx)₂–Glu–Tyr的结构特征，而簇2的D-肽则表现出类似的模式，但其C端的酪氨酸（Tyr）被色氨酸（Trp）取代。这种序列上的差异可能影响了D-肽与不同趋化因子的结合特异性。

为了进一步验证这些D-肽的结合特性，研究团队进行了表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）实验。结果显示，D-肽对L-CXCL8表现出显著的结合能力，且部分D-肽对L-CXCL1、L-CXCL4和L-CCL5等相关趋化因子也具有一定的结合能力。其中，D-1H4和D-3A11表现出较高的选择性，而D-2A5则显示出较强的非特异性结合倾向，这可能与其结构中包含三个酪氨酸（Tyr）有关。酪氨酸在趋化因子与受体的结合中起着重要作用，尤其是在与CCL5和CXCL4受体的相互作用中。因此，D-2A5的非特异性结合特性可能与其结构中多个酪氨酸的存在有关。

为了进一步研究这些D-肽的结构特性，研究团队利用核磁共振（NMR）和圆二色光谱（CD）技术对它们的二级结构进行了分析。结果表明，这些D-肽主要由β折叠和转角结构组成，其结构特征与天然L-形式趋化因子的结合模式相似。通过计算和实验验证，研究团队发现这些D-肽的结构与趋化因子的结合区域密切相关，尤其是在其环状结构和T2-CLIPS支架的结合方面。例如，D-3A11的结构显示出两个β折叠，分别位于Cys2-D-Met6和Val9-D-Cys13区域，中间由Asp–Gly结构连接。而D-2A5的结构则表现出更高的结构可变性，其β折叠之间存在四个无序的氨基酸残基，这可能影响其与趋化因子的结合特异性。

在实际应用中，这些D-肽表现出良好的抑制趋化因子与GAGs结合的能力，但对细胞迁移的抑制效果较弱。这表明，它们可能通过干扰趋化因子与GAGs的相互作用，间接影响炎症反应的进程，而不是直接阻断趋化因子的信号传导。这种特性使得它们在治疗某些炎症相关疾病时，可能具有更高的安全性，因为它们不会干扰正常的细胞迁移过程。此外，D-肽的环状结构和T2-CLIPS支架的引入，不仅提高了其结构稳定性，还增强了其结合能力，使其成为一种有前景的药物候选分子。

为了进一步探索这些D-肽的结构优化空间，研究团队还分析了其在不同条件下的结合行为。例如，通过改变肽的环状结构、调整结合区域的长度，以及引入不同的D-氨基酸变体（如β1-、β2-、同源型、N-甲基化和α-甲基化变体），可以进一步提高其结合亲和力和选择性。此外，通过调整肽的合成策略，例如使用不同的树脂、优化耦合条件以及控制反应时间，可以提高D-肽的纯度和产量，从而加快其进入临床前研究的进程。

在实验验证方面，研究团队还进行了细胞迁移实验，以评估D-肽对CXCL8诱导的细胞迁移的影响。结果显示，这些D-肽在10 μM浓度下并未显著抑制Jurkat细胞的迁移，表明它们对正常的细胞迁移过程没有干扰作用。然而，它们能够有效阻止CXCL8与GAGs的结合，从而减少趋化因子在炎症部位的聚集，降低其对炎症反应的促进作用。这一结果支持了D-肽在治疗炎症相关疾病中的应用潜力，尤其是在需要减少趋化因子活性而不影响正常免疫功能的场景下。

综上所述，本研究通过镜像显示技术成功筛选出一系列环状的D-肽，这些D-肽能够以亚微摩尔的亲和力结合CXCL8，并表现出不同的选择性。它们能够破坏CXCL8的二聚体结构，干扰其与GAGs的结合，但对细胞迁移无明显影响。这种特性使得它们在治疗炎症相关疾病时具有独特的应用优势，尤其是在需要避免抑制正常免疫反应的情况下。未来，通过进一步优化这些D-肽的结构，例如引入更多的D-氨基酸变体、调整结合区域的长度以及改进环化策略，有望开发出具有更高结合亲和力和更优选择性的新型趋化因子中和剂。这些D-肽不仅为治疗炎症相关疾病提供了新的思路，也为开发新型抗炎药物开辟了新的研究方向。