使用三种互补方法对基质效应、回收率和过程效率进行系统评估：对应用于人脑脊液中葡萄糖基神经酰胺的LC-MS/MS生物分析的影响

《ACS Omega》：Systematic Assessment of Matrix Effect, Recovery, and Process Efficiency Using Three Complementary Approaches: Implications for LC-MS/MS Bioanalysis Applied to Glucosylceramides in Human Cerebrospinal Fluid

生物分析方法验证中，整合三种互补策略（系统变异分析、整体过程效率评估、绝对矩阵效应与回收率计算）评估LC-MS/MS方法性能，解决小样本脑脊液中葡萄糖脑苷脂定量难题，提出标准化Excel工具，促进国际指南 harmonization。

　　在现代生物分析领域，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术因其高灵敏度和高选择性而被广泛应用于临床实验室和科研机构中，特别是在处理复杂生物基质中的低浓度目标化合物时。然而，LC-MS/MS方法的验证过程常常面临诸多挑战，尤其是在评估方法的准确性、精密度和灵敏度方面。这些挑战不仅源于样品本身的复杂性，还来自于实验过程中各种因素的相互作用，例如基质效应、回收率和整体过程效率。为了确保方法的可靠性和可重复性，必须对这些关键参数进行系统性评估。本文旨在通过整合三种不同的评估策略，探讨如何在单次实验中全面分析基质效应、回收率和过程效率，从而提升方法验证的效率与全面性。

基质效应是影响LC-MS/MS方法性能的一个重要因素，它指的是目标化合物在样品基质中被共洗脱的其他成分所干扰，导致离子化效率的变化。这种变化可能表现为信号的减弱（离子抑制）或增强（离子增强），从而影响定量结果的准确性。基质效应的强度与样品的组成、化合物的物理化学性质、色谱条件以及样品前处理步骤密切相关。因此，在方法验证过程中，必须充分考虑基质效应的存在，并通过适当的实验设计来评估其对方法性能的影响。回收率则衡量了目标化合物在样品前处理过程中被提取和保留的效率，而过程效率则反映了基质效应和回收率对整个分析流程的综合影响。这些参数的评估对于确保方法的稳定性和重复性至关重要。

目前，国际上对于LC-MS/MS方法的验证存在多种指导原则，但这些指南在某些方面并不一致，甚至存在模糊之处。例如，某些指南强调基质效应的评估，而另一些则更关注回收率和过程效率。此外，一些指南对实验设计和数据分析方法提出了简化的建议，而另一些则缺乏详细的评估流程。这种不一致不仅增加了实验室在方法验证过程中的不确定性，也限制了对方法性能全面理解的可能性。因此，开发一种能够整合多种评估策略的实验设计，有助于更系统地分析基质效应、回收率和过程效率，同时满足不同指南的要求。

本文提出的实验设计结合了三种互补的评估方法，旨在在单次实验中全面评估这些关键参数。第一种方法通过比较不同基质批次的峰面积和标准与内标（IS）的面积比，分析基质批次之间的变异情况。这种方法能够反映分析系统的整体性能，包括样品前处理、色谱分离和质谱检测的稳定性。第二种方法则关注整个分析流程对目标化合物定量结果的影响，通过比较不同基质批次的校准曲线斜率，评估方法的精密度。第三种方法计算基质效应、回收率和过程效率的绝对值和相对值，并通过内标进行归一化处理，从而更直观地展示这些参数如何影响方法的最终性能。

通过这三种方法的整合，本文不仅提供了对基质效应、回收率和过程效率的全面评估，还揭示了内标在补偿这些变异中的关键作用。在实际应用中，由于人体脑脊液（CSF）等生物样品的体积有限，且其中含有大量内源性物质，传统的实验设计往往难以满足这些要求。因此，本文特别针对CSF中葡萄糖脑苷脂（GluCer）同系物的定量分析，提出了一个优化的实验方案，以最小化样品体积的使用，同时确保实验结果的准确性和可重复性。

在实验过程中，首先制备了三种不同的样品集：第一种样品集（Set 1）是在纯溶剂中加入不同浓度的标准溶液和固定浓度的内标溶液，用于评估分析系统的整体性能。第二种样品集（Set 2）是在提取后的基质中加入标准溶液和内标溶液，以分析基质对离子化效率的影响。第三种样品集（Set 3）则是在提取前加入标准溶液和内标溶液，用于评估回收率和过程效率对方法性能的影响。通过这三种样品集的对比分析，可以更全面地了解基质效应、回收率和过程效率在不同实验条件下的表现。

实验结果表明，基质批次之间的变异对方法的精密度有显著影响。例如，Set 1中峰面积的变异系数（CV）范围为5.2%至13.7%，而Set 2中CV的范围为6.4%至10.4%，Set 3中CV的范围则为14.8%至34.1%。这表明，随着实验设计中引入更多的变量，如基质和回收率，方法的精密度会逐渐降低。然而，通过内标进行归一化处理后，这些变异系数显著下降，说明内标在补偿基质效应和回收率变异方面发挥了重要作用。此外，实验还发现，内标与标准溶液之间的面积比在不同基质批次中表现出较高的相关性，进一步验证了内标在提升方法稳定性方面的有效性。

在讨论部分，本文还分析了基质效应、回收率和过程效率之间的相互关系。例如，基质效应与回收率之间存在负相关趋势，这表明在某些基质批次中，较高的回收率可能伴随着更强的基质效应，反之亦然。这种现象可能与提取过程中共洗脱的干扰物质有关，这些物质可能影响目标化合物的离子化效率，从而导致基质效应的增加。因此，在方法开发过程中，优化样品前处理步骤、改进色谱分离条件以及选择合适的内标，是减少基质效应和提高回收率的关键策略。

此外，本文还强调了内标选择的重要性。内标应具有与目标化合物相似的化学结构、物理化学性质和离子化效率，以确保其在实验过程中能够有效地补偿基质效应和回收率变异。然而，在某些情况下，由于理想的同位素标记内标（如13C、15N或17O）难以获得，实验人员可能会选择氘标记的内标作为替代。尽管这种方法在一定程度上可以缓解基质效应，但其稳定性可能不如同位素标记内标，且在某些提取条件下可能发生同位素交换，影响定量结果的准确性。因此，在内标选择时，应综合考虑其化学特性、可用性和实验条件，以确保方法的可靠性。

本文还讨论了不同实验设计对方法性能的影响。例如，在样品体积有限的情况下，如何在不改变基质组成的前提下，优化实验流程以减少样品用量。同时，实验还指出，基质效应和回收率的变异可能受到多种因素的影响，包括样品前处理步骤、色谱条件和质谱参数等。因此，在方法验证过程中，应综合考虑这些因素，并通过系统性的实验设计和数据分析，确保方法的稳健性和可重复性。

最后，本文提出了一个基于Microsoft Excel的计算模板，以系统化地进行基质效应、回收率和过程效率的评估。该模板不仅能够自动计算相关参数，还能生成散点图和相关性分析，帮助实验人员更直观地理解数据。此外，本文还建议未来的研究应进一步探索不同基质条件下的方法性能，例如使用溶血或脂血基质，以及测试不同内标浓度对方法的影响。这些研究将有助于更全面地了解基质效应和回收率的动态变化，并为方法的优化提供更坚实的理论依据。

综上所述，本文通过整合三种不同的评估策略，提出了一个系统化的实验设计，以全面分析基质效应、回收率和过程效率对LC-MS/MS方法性能的影响。该方法不仅符合国际指南的要求，还为临床实验室和科研机构提供了一种实用的工具，以提升方法验证的效率和准确性。此外，本文还强调了内标在补偿基质效应和回收率变异中的关键作用，并建议在方法开发过程中，应综合考虑样品前处理、色谱条件和内标选择等因素，以确保方法的稳定性和可重复性。通过这种系统化的评估方法，实验室可以更有效地应对复杂的生物基质带来的挑战，为生物分析领域的进一步发展提供支持。