揭示骨骼肌再生机制：红光生物调控技术可促进体外肌母细胞分化

《The FASEB Journal》：Shining a Light on Skeletal Muscle Regeneration: Red Photobiomodulation Boosts Myoblast Differentiation In Vitro

红光生物调节（635±10 nm）以4 J/cm2能量密度处理C2C12肌细胞，通过形态学、生化及电生理分析，证实可有效促进肌原细胞分化，增强肌管形成、线粒体生物合成与活性，并增加促肌外泌体分泌，而对成熟肌管存活无影响。该研究为骨骼肌再生提供实验依据。

　　光生物调节（Photobiomodulation, PBM）是一种非侵入性的治疗手段，通过使用特定波长的光（通常为600至1100纳米）来促进受损肌肉组织的再生。尽管PBM在促进肌肉修复方面显示出一定的潜力，但其实际效果仍存在争议，尤其是在影响肌肉卫星干细胞（satellite cells, SCs）的治疗参数方面，尚未达成共识。因此，本研究旨在探讨红光PBM治疗对小鼠肌母细胞分化及成熟肌管（myotubes）的影响，结合形态学、生物化学和功能分析，以揭示其促进肌肉再生的机制。

### 肌肉再生的机制与卫星细胞的作用

肌肉组织在人体中占据约40%的总质量，承担着多种关键功能，包括运动、力量生成、能量储存、呼吸和代谢等。肌肉再生主要依赖于一种被称为卫星细胞的特殊干细胞群体。这些细胞位于成熟肌纤维的基底膜与肌膜之间，构成了一个独特的微环境，即“龛”（niche）。在正常成人肌肉中，卫星细胞处于静止状态，其特点是低代谢水平、低细胞周期活性以及低RNA水平。当肌肉受到损伤或接收到生长信号时，这些细胞会被激活，进入细胞周期，从而快速增殖并分化为新的肌细胞，以修复受损的组织。

卫星细胞的分化过程受到多种信号的调控，包括细胞外基质（extracellular matrix, ECM）成分、生长因子、细胞因子、氧气浓度、pH值以及细胞间的相互作用等。这些信号通过复杂的分子机制调控卫星细胞的活性和命运。此外，卫星细胞在分化过程中会通过不对称分裂产生自我更新的干细胞和肌源性前体细胞，这些细胞迁移到损伤区域，增殖并最终融合形成多核的肌管，从而恢复肌肉的功能。

然而，在反复损伤或慢性肌肉损伤的情况下，肌肉组织可能无法完全恢复其形态和功能。这主要是因为卫星细胞的功能可能受到抑制，同时纤维母细胞和肌纤维母细胞可能会产生过多的ECM成分，导致肌肉组织被纤维脂肪组织替代。因此，寻找一种既能促进肌肉再生又能抑制异常纤维化反应的治疗手段，是当前肌肉修复研究的重要目标。

### 光生物调节的原理与应用

光生物调节，又称为低强度激光治疗（low-level laser therapy, LLLT），是一种非热的光照射疗法，使用激光或发光二极管（LED）在红光或红外光谱范围内（波长600–1100纳米）进行治疗。其作用原理是通过特定波长的光穿透组织，激活细胞内的光敏分子，如细胞色素C氧化酶（cytochrome C oxidase），从而引发一系列生物化学反应，包括ATP生成、一氧化氮（NO）释放、活性氧（ROS）水平变化等。这些反应能够调节细胞代谢活动，促进细胞分化和修复过程。

PBM在多个医学领域已得到广泛应用，包括骨科、康复医学和生物工程等。其安全性较高，副作用较少，且具有局部治疗的优势，避免了系统性风险。然而，关于PBM在肌肉再生中的效果，目前仍存在一定的争议。研究发现，不同波长、能量密度、照射方式和时间等参数对治疗效果有显著影响。因此，明确这些参数对于优化PBM治疗至关重要。

本研究采用了一种非接触式连续波红光PBM治疗，波长为635±10纳米，能量密度分别为0.4、4和8焦耳每平方厘米。这种治疗方式在细胞培养实验中被应用，以评估其对小鼠肌母细胞分化及成熟肌管的影响。通过多种实验方法，包括细胞活力检测、形态学分析、生物化学检测和电生理分析，研究者能够全面评估PBM对肌肉细胞的影响。

### 实验设计与结果

本研究使用了C2C12小鼠肌母细胞，这些细胞在增殖培养基（proliferation medium, PM）中培养，随后在分化培养基（differentiation medium, DM）中诱导分化。PBM治疗被应用于不同的时间点，包括细胞播种后24小时（PM中）或在转移至DM后30分钟（DM中）。细胞活力通过MTS实验进行检测，结果显示，三种红光PBM治疗均未对细胞活力造成显著影响，表明PBM具有一定的安全性。

在形态学分析中，研究者观察到红光PBM治疗（尤其是4 J/cm2能量密度）能够显著促进肌母细胞的分化和肌管的形成。通过对比相位光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy, CLSM）分析，发现红光PBM治疗的细胞在分化过程中表现出更明显的伸长和肌管形成，而这些变化在对照组中并未出现。此外，细胞骨架中的F-actin组织也得到了改善，表明细胞的分化过程受到促进。

在生物化学分析中，研究者检测了肌源性转录因子MyoD和myogenin的表达水平。结果表明，红光PBM治疗显著增加了这些因子的表达，表明其能够促进肌源性分化。此外，PBM还增强了线粒体的生物合成和代谢活动，通过透射电镜（transmission electron microscopy, TEM）和机器学习分析，发现线粒体的数量和活性在PBM治疗后显著增加，这可能与线粒体生物合成相关。同时，研究者还检测了细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）的释放情况，发现红光PBM能够促进EVs的分泌，这些EVs具有促进肌肉分化的特性。

在电生理分析中，研究者通过全细胞膜片钳技术（whole-cell patch clamp）评估了细胞膜的被动特性及内向离子电流的变化。结果表明，红光PBM治疗能够显著促进细胞膜的超极化，并增强内向钙离子电流（I_Ca）。这些变化与细胞的分化过程密切相关，可能通过调节细胞膜的离子通道活性，促进细胞的分化和功能恢复。

### 促肌源性作用的机制

研究发现，红光PBM的促肌源性作用可能与多个分子机制相关。首先，红光能够被细胞色素C氧化酶有效吸收，从而激活细胞内的信号通路，包括ATP生成、NO释放和ROS水平变化等。这些信号能够调节细胞代谢活动，促进细胞分化。其次，红光能够穿透肌肉组织，尤其在600–700纳米波长范围内，由于血红蛋白和肌红蛋白的吸收较低，因此能够深入肌肉组织，影响深层细胞的活动。

此外，红光PBM还能够促进细胞外囊泡的释放，这些囊泡中含有多种促肌源性因子，如IL-6和VEGF。IL-6是一种促炎因子，但在某些情况下能够促进细胞分化，而VEGF则与血管生成和细胞存活密切相关。这些因子的释放可能为肌肉再生提供了额外的信号支持，从而促进细胞的分化和功能恢复。

### 潜在的应用与挑战

尽管本研究提供了红光PBM在促进肌肉再生方面的实验依据，但将其应用于临床仍面临一些挑战。首先，PBM的治疗参数在不同组织和个体中可能有所不同，因此需要进一步优化以适应不同的治疗需求。其次，PBM在体外实验中表现出的促肌源性作用是否能够在体内实现，仍需进一步验证。体内组织的结构复杂性、代谢差异、血管供应和免疫反应等因素可能影响光的穿透深度和治疗效果。

此外，PBM的剂量反应曲线显示，低能量密度的光可能比高能量密度的光更有效，因此需要确定最适合作用的能量密度。同时，PBM的治疗效果可能受到多种因素的影响，包括光的波长、照射时间和细胞类型等。因此，未来的研究需要进一步探索这些参数之间的相互作用，以优化治疗方案。

### 结论与展望

本研究提供了实验证据，表明红光PBM能够促进小鼠肌母细胞的分化和肌管的形成，同时不影响成熟肌管的活力和形态。这些结果为PBM在肌肉再生领域的应用奠定了基础，同时也为进一步的临床研究提供了重要的参考。尽管PBM在体外实验中表现出良好的促肌源性作用，但其在体内的应用仍需更多的研究支持。

未来的研究应关注如何将体外研究结果转化为临床应用，这需要考虑体内组织的复杂性和个体差异。此外，进一步探索PBM的分子机制，如其对线粒体生物合成、细胞外囊泡释放和离子通道活性的影响，将有助于更好地理解其促肌源性作用。同时，开发个性化的PBM治疗方案，以适应不同类型的肌肉损伤和患者需求，也是未来研究的重要方向。

总之，PBM作为一种非侵入性的治疗手段，具有在肌肉再生领域应用的潜力。然而，要实现其临床转化，还需要克服多个挑战，包括优化治疗参数、验证体内效果以及深入理解其分子机制。通过进一步的研究和临床试验，PBM有望成为一种有效的肌肉修复治疗方法。