基于磷修饰的体外单链线性与环状DNA制备新方法及其在功能筛选中的应用

《Journal of Biological Chemistry》：Simple in vitro single stranded linear and circular DNA preparation, functional selection and validation using phosphor-derived modifications

本研究针对单链环状DNA（sscDNA）制备技术复杂、效率低的难题，开发了一种基于磷酸化-硫代磷酸化修饰引物的简单高效方法。研究人员通过优化PCR和连接反应条件，成功实现了单链DNA的高效制备与环化，并应用于MERS-CoV刺突蛋白的适配体筛选。该方法避免了传统方法的dsDNA杂质问题，简化了操作流程，为分子生物学中依赖单链DNA的技术提供了强有力的工具，具有自动化潜力。

　　

在分子生物学研究领域，单链DNA（ssDNA）的制备是许多关键技术的基础，包括系统演化配体指数富集（SELEX）、寡核苷酸微阵列、PCR垫片探针（PLP）生成以及基因编辑等。然而，开发简单、快速、高效且用户友好的纯ssDNA制备技术一直是个挑战。传统方法如变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、生物素-链霉亲和素法以及不对称PCR等，存在操作繁琐、易产生双链DNA（dsDNA）杂质、或与需要5‘-磷酸化末端的应用不兼容等问题。特别是，λ外切核酸酶（Lambda exonuclease）降解5’-磷酸化链的特性虽然可用于制备ssDNA，但也使得后续需要5‘-磷酸化末端的应用（如环状DNA制备）必须额外进行磷酸化步骤，增加了流程的复杂性。因此，亟需一种能够同时满足高纯度、操作简便且兼容多种应用场景的ssDNA制备新方法。

为了应对这一挑战，研究人员在《Journal of Biological Chemistry》上发表了一项创新性研究。他们提出了一种利用磷酸化-硫代磷酸化修饰引物进行体外单链线性及环状DNA制备、功能筛选和验证的简单方法。该方法的核心在于巧妙利用化学修饰来调控酶的活性，从而简化整个流程。

研究人员在开展本研究时，主要运用了几个关键技术方法。他们首先优化了使用修饰引物（磷酸化反向引物和磷酸化-硫代磷酸化正向引物）的PCR条件。随后，利用λ外切核酸酶选择性降解非硫代磷酸化修饰的链，从而获得5‘-磷酸化的单链PCR产物（ssPCRP）。关键的创新在于，他们发现硫代磷酸化修饰能够有效抑制λ外切核酸酶对5’-磷酸化链的降解，即使该链已被磷酸化。这使得产生的ssPCRP无需额外磷酸化即可直接用于环化。接着，他们使用 bridging oligonucleotide（桥连寡核苷酸）和DNA连接酶（T4 DNA连接酶或Taq DNA连接酶）进行ssPCRP的环化反应，并通过引入额外的胸腺嘧啶（T）核苷酸来补偿Taq DNA聚合酶在PCR过程中添加的额外腺嘌呤（A）核苷酸，从而显著提高了连接效率。最后，他们通过超支化滚环扩增（HRCA）验证环状ssPCRP的成功形成，并将该技术应用于针对MERS-CoV（中东呼吸综合征冠状病毒）刺突蛋白（Spike protein）的线性及环状适配体（aptamer）的SELEX筛选过程中，共进行了15轮筛选，其中包括4轮使用琼脂糖磁珠和溶菌酶蛋白的负筛选以排除非特异性结合。

PCR优化使用修饰引物

研究人员通过梯度PCR确定了最佳退火温度（68°C），并验证了使用磷酸化反向引物以及不同类型的正向引物（硫代磷酸化、磷酸化-硫代磷酸化、正常、磷酸化）进行PCR反应，结果表明化学修饰不影响PCR条带质量。实时定量PCR（qPCR）显示，虽然使用修饰引物信号强度降低约25%，但产物量仍足以满足应用需求。优化PCR条件对于获得单一长度dsDNA至关重要，这直接影响后续外切酶处理产率和环状DNA形成。

硫代磷酸化保护5‘-磷酸化DNA免于降解

研究证实，λ外切核酸酶能高效降解5’-磷酸化dsDNA链，但其降解活性在含有5个硫代磷酸化修饰的5‘-磷酸化链上被完全抑制。即使正向引物被磷酸化，只要其5’端含有硫代磷酸化修饰，就能在λ外切酶处理后被保护下来，形成磷酸化的ssPCRP。而使用仅磷酸化（无硫代磷酸化保护）的正向引物，则两条链均被降解。此外，外切核酸酶I（Exonuclease I）能消化线性ssPCRP，证实了其单链性质。利用[γ-³²P]放射性标记和变性PAGE进行的灵敏检测进一步验证了硫代磷酸化修饰的保护作用。

ssPCRP环化

研究比较了不同长度（50, 42, 35碱基）的桥连寡核苷酸、是否包含额外T核苷酸（用于补偿Taq聚合酶添加的A）以及两种DNA连接酶（T4 DNA连接酶、Taq DNA连接酶）对ssPCRP环化效率的影响。结果表明，使用T4 DNA连接酶时，含有额外T的42和35碱基桥连寡核苷酸环化效率最高（90%-95%），而缺少额外T会导致连接效率显著下降。Taq DNA连接酶对桥连寡核苷酸长度和额外T的依赖性较低，但选择性稍差。最终选择T4 DNA连接酶进行环化，因其效率高、价格低、反应温度温和，更用户友好。研究还指出，连接酶对硫代磷酸酯键的连接存在立体特异性（Rp构型更易连接），这可能影响整体连接效率。成功的环化通过HRCA反应得到验证。

HRCA反应使用环化ssPCRPs

将环化ssPCRP作为模板进行HRCA反应，使用SYBR Green实时监测和琼脂糖凝胶电泳验证，证实环状DNA模板能成功进行指数级扩增，产生高分子量的超支化DNA。Bst DNA聚合酶显示出比phi29 DNA聚合酶更好的扩增效率和灵敏度。该方法也成功应用于更长片段（300和1000碱基）ssPCRP的制备和环化。

SELEX基于磷酸化-硫代磷酸化引物

将该方法应用于针对MERS-CoV全长刺突蛋白及其受体结合域（RBD）的线性与环状适配体的SELEX筛选。经过15轮筛选和负筛选，获得了富集的适配体库。对筛选出的代表性线性与环状适配体进行解离常数（K_D）测定，通过滤膜结合实验（Filter assay）测得针对全长刺突蛋白的K_D值在纳摩尔（nM）水平，证明了所选适配体的高亲和力。而针对RBD筛选的适配体与全长刺突蛋白未显示结合。

本研究成功开发了一种简单、高效、用户友好的单链线性及环状DNA制备新方法。该方法的核心优势在于利用磷酸化-硫代磷酸化修饰引物，使得通过λ外切核酸酶处理后得到的ssDNA本身就带有5‘-磷酸，可直接用于连接酶催化的环化反应，省去了额外的磷酸化步骤。同时，通过优化连接条件（如桥连寡核苷酸长度、引入补偿性T核苷酸），显著提高了环化效率。与传统的凝胶分离法、生物素-链霉亲和素法、不对称PCR以及环到环扩增（C2CA）等方法相比，该方法操作更简单（全流程在单管中进行）、产物纯度更高（无dsDNA杂质）、且兼容需要5’-磷酸化的应用。该方法已成功应用于SELEX筛选，获得了针对MERS-CoV刺突蛋白的高亲和力线性与环状适配体，验证了其在实际应用中的有效性。

这项研究的重要意义在于，它为解决单链DNA制备中的关键瓶颈问题提供了一个强有力的工具。该方法不仅简化了现有流程，提高了效率，而且由于其不依赖凝胶电泳，全流程可在单管内完成，使其非常适合于高通量自动化的应用场景。这使得它在许多领域具有广阔的应用前景，例如：SELEX筛选、PCR垫片探针制备、单链DNA文库构建、基于滚环扩增的信号放大、长读长测序技术（如Nanopore, PacBio）中的模板制备，以及CRISPR基因编辑中长单链DNA供体的制备等。因此，这项技术有望推动分子生物学、遗传学、诊断学和治疗学等多个相关领域的技术进步。