基于AlphaFold2和密度引导模拟的冷冻电镜替代态建模新方法

《Communications Chemistry》：Modeling cryo-EM structures in alternative states with AlphaFold2-based models and density-guided simulations

本研究针对多态性膜蛋白在冷冻电镜结构解析中的挑战，开发了一种结合人工智能生成与分子动力学模拟的创新流程。研究人员通过AlphaFold2的多序列比对采样生成构象集合，结合密度引导的分子动力学模拟，成功对钙降素受体样受体(CLR)、L型氨基酸转运体(LAT1)和丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸转运体(ASCT2)三种膜蛋白的替代功能态进行精准建模。该方法显著提升了中等分辨率冷冻电镜图下的结构建模精度，为动态膜蛋白的结构功能研究提供了新范式。

　　

在结构生物学领域，冷冻电子显微镜（cryo-EM）技术的突破使得科学家能够以近原子分辨率观察生物大分子的精细结构。然而，当蛋白质存在多个功能状态时，特别是当某些状态缺乏合适的分子模板且图谱分辨率不足以进行从头建模时，准确解析其三维结构仍面临巨大挑战。这种困境在药理相关的膜结合受体和转运蛋白中尤为常见，这些蛋白往往通过复杂的构象变化执行其生理功能。

传统密度引导分子动力学（MD）模拟虽然可通过偏向势将原子向实验密度图移动，但其成功高度依赖于初始模型的可靠性。当已知结构与目标密度图代表的构象差异较大时，常规方法往往产生拟合不佳或非物理的模型。

为解决这一难题，来自瑞典皇家理工学院和斯德哥尔摩大学的研究团队在《Communications Chemistry》上发表了一项创新性研究，开发了一种将人工智能生成模型与柔性拟合相结合的新方法。该研究通过AlphaFold2的多序列比对（MSA）深度随机子采样生成构象集合，结合结构聚类和密度引导MD模拟，成功实现了对三种经历显著构象变化的膜蛋白的精确建模。

研究方法主要包括四个关键步骤：首先通过AlphaFold2的MSA子采样生成1250个初始模型；其次基于广义方向依赖性全原子势（GOAP）进行质量过滤后，通过k-means聚类筛选代表性结构；然后对聚类代表进行密度引导MD模拟；最后根据图谱拟合度（交叉相关性）和模型质量（GOAP得分）的综合评分选择最终模型。

测试案例1：7-TM受体中的螺旋弯曲

研究人员首先在钙降素受体样受体（CLR）中验证了该方法。CLR是G蛋白偶联受体，其第六跨膜螺旋（TM6）在激活状态会发生明显弯曲，重塑细胞内结合界面以允许与Gs蛋白α亚基相互作用。

研究结果显示，基于生成集合的方法得到的最终模型与激活态实验结构仅偏差1.25?（Cα RMSD），成功包含了激活态的特征性扭结。而标准方法从已知非活性结构出发的拟合模型全局偏差达2.39?，局部TM6区域偏差高达6.42?。新方法在模型几何质量（-95.9 vs -91.2 GOAP评分）和密度拟合度（0.79 vs 0.75交叉相关性）方面均优于标准方法。

测试案例2：12-TM转运体中的多螺旋重排

在L型氨基酸转运体（LAT1）的研究中，该蛋白在抑制状态下TM1和TM6螺旋围绕双碘酪氨酸（diiodo-Tyr）结合位点发生重排。尽管目标密度图分辨率较低（3.4?），新方法仍成功建模了这一多螺旋构象变化。

最终模型与抑制态目标结构仅偏差1.44?，TM1/TM6区域偏差为1.52?，且与抑制剂结合模式兼容。相比之下，标准方法拟合的模型在关键区域偏差达4.08?，并导致酪氨酸残基与预期抑制剂姿势发生冲突。

测试案例3：8-TM转运体中的结构域重排

在ASCT2同源三聚体转运蛋白研究中，该蛋白通过"单门电梯"机制在内向开放和外向开放状态间转换，涉及支架结构域和转运结构域之间的相对运动。

尽管构象变化分布广泛，新方法仍将最终模型与目标结构的偏差控制在3.65?，而标准方法偏差高达10.16?。所有跨膜螺旋在最终模型中均与目标结构高度重叠，证明了该方法在处理大规模构象变化中的有效性。

研究讨论部分指出，该方法成功应用于CLR的螺旋弯曲、LAT1的多螺旋重排和ASCT2的结构域重排三种不同类型的构象变化，表明其适用于多种动态膜蛋白系统。与需要手动干预的传统方法相比，该自动化流程在有限的结构生物学专业知识背景下仍能实现高精度建模。

值得注意的是，该方法不依赖于任何已知的替代态结构，仅利用序列信息和目标密度图即可实现准确建模。即使在初始生成集合中包含更接近目标结构的模型，仅凭密度图相关性也无法在模拟前识别这些最优模型，凸显了结合聚类和模拟流程的必要性。

该研究的成功实施为膜蛋白动态结构研究提供了强大工具，特别是在药物靶点表征和功能机制解析方面具有重要应用价值。未来随着人工智能采样策略的进一步优化，该方法有望扩展到更复杂的生物大分子体系，推动结构生物学向动态化和系统化方向发展。